صنایع شیمیایی

 

 

ويژگيهای فاز ساکن  مايع  

1-نقطه جوش خيلی بالا (حداکثر ºC 100 بيشتر از دمای جداسازی)

2-خصوصيات مايعات را داشته باشد (گونه بتواند داخل آن نفوذ کند و توزيع صورت پذيرد)

3-پايداری حرارتی داشته باشد.

4-از نظر شيميايی خنثی باشد (تا با اجزاء نمونه برهم کنش نداشته باشد).

اين ويژگيها باعث می شود تعداد فاز های ساکن محدود و تنوع کمی داشته باشد.

 

Capillary columns

اولين بار در سال 1950 Marcl Golay ستونهای کاپيلاری را معرفی کرد. متاسفانه چون patent بود رشد نکرد (در انحصارکمپانی hp) وقتی از انحصار درآمد رشد زيادی کرد.

 

مزايا:

1-رزولوشن بالا

2-سرعت آناليز بالا

3-حساسيت بيشتر (چون باندها تيز است)

4-امکان جداسازی با رنج وسيعی از ترکيبات

5-کم بودن اثر مزاحمتها

6-تکرارپذيری از ستونی به ستون ديگر زياد است .

 انواع ستونهای کاپيلاری

الف- :(WCOT)بيشترين کاربرد را دارند جنس اين ستونها از fused silica، ديواره داخلی آنها از فاز ساکن و ديواره بيرونی از پلی ايميد پوشيده شده است که تا ºC 375 پايدار است. اگر بخواهند تا ºC 500 مقاوم کنند از پوشش آلومينيوم استفاده می کنند. اين ستونها نبايد به داخل دتکتور وارد شود زيرا اتصال کوتاه ايجاد می کنند.

ب-(PLOT) Porous layer open tubular يا  :(SCOT) Support coated open tubular ابتدا فاز ساکن را روی نگه دارنده قرار می دهند و سپس آنرا روی ديواره ستون قرار می دهند.

ج-micropacked capillary column: اين ستونها فاز ساکن مايع ندارند. داخل ستون را با ذرات پرکننده پر می­کنند. کاربرد اين ستونها برای جداسازی مولکولهاست.

 

                                                      

r: شعاع ستون

r_p: شعاع ذره

Stationary phase criteria and development

نکته مهم در ستونها فاز ساکن است.

ويژگيهای فاز ساکن:

1-پايداری حرارتی

2-پايداری فيزيکی (وقتی بشکل فيلم درآمد حالت خود را حفظ کند)

3-دارای ويژگی cross linking يا شاخه دارشدن باشد. هرچند اين شرط اصلی نيست ولی باعث افزايش پايداری حرارتی و فيزيکی می شود و به ستون قابليت شستشو می­دهد.

4-بايد گونه ها بتوانند وارد آن شوند، partition with solute molecule ، به همين دليل برای هر ستونی يک دمای حداقل تعريف می کنيم دمايی است که در آن فاز ساکن حالت خود را از دست می دهد و توزيع اتفاق نمی افتد. ماکزيمم و مينيمم دمای فاز های ساکن در جداول شماره 1 آمده است.

5-chemical inertness to solute molecules

6-phase selectivity: انتخابگری داشته باشد در غيراينصورت نمی تواند گونه های نزديک بهم را جدا کند.

برهم کنشهای بين فاز ساکن و گونه انتخابگری را می دهد.

        

انواع برهم کنشهای بين فاز ساکن و گونه

-واندروالسی

-دوقطبی-دوقطبی

-  dipole- induced dipole

-acid-base interactions

-molecular shape separation (توانايی برای تشخيص شکل مولکولها)

 

7-polymer reproducibility

 

انواع فازهای ساکن که بطور معمول استفاده می شوند:

a)silicons

مهم ترين دسته فازهای ساکن هستند.

              

  مزايا:

1-قسمت پليمری انعطاف پذيری خوبی دارد در دماهای کم به مولکولها اجازه نفوذ می دهد.

2-پايداری حرارتی خيلی خوبی دارند (حدود ºC 300).

3-تغييرات ويسکوزيته فاز ساکن جزئی است.

4-قابليت تشکيل فيلمهای خوبی دارد.

b) polyethylene glycol (PEG)  

کاربرد اينها بعد از دسته اول است. جزو فازهای ساکن قطبی محسوب می شود و سالهای زيادی بعلت مشکلاتی که در شاخه دار شدن سيلوکسانهای قطبی وجود داشت بعنوان قطبی ترين فاز ساکن محسوب می شده است.

ولی امروزه فازهايی مانند سيانو پروپيل سيلوکسان عرضه شده که جای آنها را گرفته است.

 

معايب:

1-پايداری حرارتی کم

2-براحتی توسط آب و اکسيژن موجود در فاز متحرک تخريب می شود.

 

کاربرد: برای آناليز اسيدهای چرب

خريدشان توصيه نمی شود.

(در هنگام استفاده از دتکتور ECD و ستونهای PEG بخصوص در دماهای بالا حتما بايد نمونه خشک باشد)

c) modified siloxane polymers

برای افزايش قابليت کاپيلاری به دماهای بالا از اين نوع فاز ساکن استفاده می کنند در اين سيستمها حلفه بنزن يا کربوران در زنجيره پليمری قرار می گيرد. که باعث افزايش دما تا ºC 480 می شود.

        

d) solid adsorption chromatography

ستونهای کاپيلاری برای آناليز گازها يا مولکولهای سبک در رقابت با ستونهای packed به بازار آمده اند. اين نوع فازهای ساکن می توانند در مود PLOT و يا packed capillary کاربرد داشته باشند در اين سيستمها از فازهای ساکنی مانند مولکولار سيوها، اکسيد آلومينيوم و پليمرهای شاخه دار مانند استايرن دی ينيل بنزن استفاده می کنند.

 e)chiral phases

فاز ساکن از جنس سيکلودکسترينها است و جداسازی مولکلولهای کايرال با اين سيستم انجام می شود. سيکلودکسترين يک اليگومر حلقوی است که در يک فاز ساکن سيلوکسان استخلاف شده است. مولکولهای آلی با اندازه و شکل درست می توانند با حفره موجود در سيکلودکسترين برهم کنش نموده و در ستون کاپيلاری قويتر نگه داشته شوند.

Manufacturing methods

1-اولين کار تنظيم سطح داخلی ستون است. معمولا از طريق اسيدشويی و حرارت کاری می کنند که تمام گروههای سيلانول در دسترس قرار گيرند، اين گروههای فعال می توانند مشکل ساز باشند.

2-گروههای فعال داخل سطح ستون را غيرفعال می کنند تا اثرات کاتاليستی و جذب کنندگی آنها از بين برود. معمولا گروههای غيرفعال کننده متناسب با فاز ساکن انتخاب می شوند.

3- پس از غيرفعال شدن سطح داخلی مرحله بعدی coating است که معمولا برای آن از سيستم استاتيک استفاده می شود. غلظت معينی از فاز ساکن را در حلال حل می کنند سپس ستون را با اين محلول پر می کنند و يک سر آن را با حرارت می بندند و به سر ديگر خلاء اعمال می کنند. با اعمال خلاء بتدريج حلال تبخير و فاز ساکن با ضخامت مشخصی ديواره داخلی ستون را می پوشاند.

4-crosslinking يا شاخه­دار شدن: فيلم ايجاد شده پايداری لازم را ندارد و در مقابل افزايش دما و شستشوی ستون ممکن است از دست برود. شاخه دار شدن اين لايه يک پليمر نامحلول و از نظر فيزيکی پايدار می دهد. شاخه دار شدن معمولا از طريق واکنشی که راديکالی آغاز می شود صورت می پذيرد. با استفاده از ترکيبات آزو، پراکسيدها يا تابش گاما راديکالهای آزاد توليد می شوند. از پليمرهايی که گروههای انتخابی سيلانول دارند در اين واکنش استفاده می شود. سپس داخل ستون را با حلال فراری شستشو می دهند تا ترکيبات اضافی خارج شود. سپس عمل conditioning يا بهينه سازی انجام می شود و از ستون در جداسازيها استفاده می شود.

 

ارزيابی عملکرد ستون:

ستون قبل از استفاده بايد ارزيابی شود (برای اين کار از پارامترهايی استفاده می شود):

1-قدرت جداسازی: قدرت جداسازی ستونهای کاپيلاری برحسب تعداد پيکهای تفکيک شده در زمان آناليز تصور می شود. هرچه پيکها باريک تر باشند ظرفيت پيک آناليز بيشتر می شود و تفکيک ستون بالاتر است.

2-تعيين پارامترهای کارايی و عملکرد:

الف-پارامترهای بازداری:  t_M، t_R و w_1/2 داده هايی هستند که برای محاسبه کارايی و عملکرد بکار می روند (شکل 7).

ب-تعداد بشقابکهای تئوری (N_TH): بکمک يک استاندارد تعيين و باستونهای مشابه مقايسه می شود.

                                         

پ-بشقابکهای موثر (N_EFF):

                                       

کارايی های تئوری و موثر تنها وقتی تعيين می شوند که کروماتوگرام تحت شرايط ايزوترمال بدست آيد. مقادير N_TH و N_EFF بسيار به نسبت ظرفيت پيکی که زمان بازداری کوتاهی دارد وابسته هستند.

ت-مقدارنسبت ظرفيت k' (يا نسبت يا فاکتور تقسيم):

 

3-مقدار α

4- مقدار kovats retention index

5-سرعت آناليز

6-sample capacity

7-inertness (پارامتر مهمی است)

وقتی ستونی ترکيبات را جذب کند اين جذب می تواند برگشت پذير يا برگشت ناپذير باشد. اگر برگشت پذير باشد پيکها دنباله دار و اگر برگشت ناپذير باشد باعث می شود ارتفاع پيکها کم شود و يا حتی براثر برهم کنش با بعضی گونه ها منجر به شکستگی يا ايجاد تغييرات در ساختار ترکيبات شود. در اين زمينه ها تلاشهای زيادی انجام می گيرد تا ستونهايی که تهيه می شوند کاملا بی اثر باشند.

8-bleed

آزمونهای تعيين ميزان فعاليت ستونها

1-تست :Grob ممکن است ستونinert  باشد ولی چند استفاده فعال شود.

 

عوامل موثر در تغيير فعاليت ستون (شکل 12 مثالها).

 

1-آلودگی ستون با نمونه

2-آلودگی ستون با گاز حامل (بعضی از ناخالصيهای موجود در گاز) معمولا از هنگامی که فشار سيلندر گاز حامل به کمتر از bar 10 برسد بهتر است از آن استفاده نشود زيرا ناخالصيهای موجود ته نشين شده در انتهای آن وارد ستون می شوند.

3-تخريب فاز ساکن در اثر کار در دماهای بالا

4-تخريب ابتدای ستون برا اثر وارد شدن ذرات

 

چگونه می توان اثر اين عوامل را کاهش داد؟

-با کاهش زمان اقامت نمونه ها در ستون می توان تاثيرات متقابل گونه باستون را کاهش داد.

- تا حد امکان از سرعتهای بالای گاز حامل استفاده شود

- از ستونهای کوتاه استفاده شود

-از ramp های بزرگ استفاده شود

يکی از مهم ترين عواملی که بی اثر بودن ستون را از بين می برد، bleed است (خارج شدن تدريجی فاز ساکن از انتهای ستون است) که يا بر اثر تبخير يا بر اثر تخريب می تواند رخ دهد.

 

نتايج ناشی از bleed

1-کاهش حساسيت اندازه گيری (بعلت افزايش سطح خط پايه)

2-عدم پايداری زمينه منجر به خطا در انتگرالگيری می شود و تکرارپذيری و صحت را از بين می برد.

3-آلوده شدن دتکتورهای حساس مثل MS شود (شکل 14)

يک سری از bleedings غيرطبيعی هستند و در اثر تخريب رخ می دهند.

عوامل موثر در تخريب فاز ساکن

1-تخريب کاتالتيکی در اثر وجود مقادير جرئی

2-تخريب براثر تزريق نمونه های اسيدی و بازی به ستون

3-حضور اضافی ترکيباتی که برای شاخه دار شدن ستونها استفاده شده

4-حضور مقادير جزئی اکسيژن در فاز ساکن

روش تشخيص تغيير در خط پايه در اثر ناخالصی يا دما:

اگر دما را ثابت نگه داريم و خط پايه ثابت بماند ناشی از bleeding است و اگر پايين آمد مربوط به ناخالصی است. ميزان bleeding به طول ستون و ضخامت فاز ساکن بستگی دارد. ميزان bleeding فاز ساکن پلی دی متيل سيلوکسان در ستونهای مختلف با طول و قطرهای مختلف در جدول 4 آمده است.

نحوه انتخاب ستون

هدف از انتخاب ستون مناسب

1-حساسيت بالا

2-افزايش سرعت آناليز

3- استفاده از ستون با قيمت کم

4-قابليت اعتماد به آناليز

برای دستيابی به اين اهداف بايد پارامترهای زير را در نظر گرفت:

1-نوع فازساکن (مهم ترين)

2-قطر داخلی ستون

3-ضخامت فيلم فاز ساکن

4-طول ستون

مهم­ترين پارامتر در انتخاب نوع فاز ساکن انتخابگری ستون يا α است. اگر α برای يک جداسازی بزرگ باشد می توان جداسازيها را با رزولوشن بالا و زمان کوتاه انجام داد. در انتخاب ستون ابتدا بايد سعی شود جداسازيها را با پلی دی متيل سيلوکسان انجام داد. علت اين است که در اينجا تاثيرات متقابل ستون با گونه از نوع واندروالسی است و گونه ها به ترتيب نقطه جوش از ستون خارج می شوند. در صورتيکه اين ستون موفق نبود ستون با 5% بی فنيل پلی دی متيل سيلوکسان انتخاب شود و اگر گونه ها قطبی باشند اين ستون هم قادر به جداسازی نخواهد بود و در اينصورت بايد از ستون 70% cyanopropyl (BP10) استفاده کنيم. (مثالهای ص 94 و 95).

       

بنابراين اولين انتخاب ستونی با فاز ساکن غيرقطبی و بعد ستونهايی با ترتيب افزايش قطبيت است و نه برعکس.

عامل موثر ديگی قطر داخلی ستون است. کارايی ستون با قطر داخلی رابطه معکوس دارد. هر قدر قطر داخلی ستون کمتر باشد حساسيت اندازه گيری افزايش می يابد.

 

برای انتخاب قطر داخلی مناسب چند مسئله را بايد در نظر بگيريم:

1-جداسازی موردنياز (سادگی يا پيچيدگی)

2-سرعت جداسازی مورد نياز

3-حساسيت موردنياز

4-سادگی کار

5-امکان اتصال به دستگاه MS

 

انواع ستونها از نظر قطرداخلی

1-widebore (ستونهای با قطر mm 53/0): استفاده از اين ستونها خيلی راحت است و آنها را بسادگی می توان با استفاده از فرولها و فيتينگهای مناسب جايگزين ستونهای packed کنيم. سرعت گاز حامل در اين ستونها ml/min 30-20 و ظرفيت نمونه گذاری آنها بالاست.

 

2-ستونهای با قطر متوسط (mm32/0) و کوچک (mm22/0): اين ستونها بيشترين کاربرد را دارند. چون حساسيت و قدرت جداسازی اين ستونها از دسته اول بيشتر است می توان از سيستمهای مختلف تزريق برای آنها استفاده کرد. درصورت نياز به رزولوشن بالا از ستونهای mm 22/0 استفاده می شود. اين ستونها اهميت بيشتری دارند.

 

3-ستونهای با قطر ميکرو (mm15/0): کار با اين ستونها بسيار سخت است ولی قدرت جداسازی خيلی بالايی دارند و سرعت جريان گاز حامل در آنها خيلی کم است. لذا در سيستم GC/MS اهميت خاصی دارند.

 

4-ستونهای با قطر ميکرو (mm1/0): اگر چه سرعت جداسازی اين ستونها بالاست ولی ظرفيت نمونه گذاری آنها خيلی پايين و تزريق نمونه به اينها خيلی مشکل است. لذا نسبت به بقيه کاربرد کمتری دارند. عملکرد ستونهای کاپيلاری مختلف در جدول 5 آمده است.

    

ضخامت فيلم فاز ساکن film thickness: در اين مورد بهتر است از پارامتر β

استفاده شود. هر قدر β کوچکتر باشد ضخامت و ظرفيت نمونه گذاری بيشتر می شود و زمان خروج گونه ها از ستون افزايش می يابد. اگر دو ستون با طول يکسان داشته باشيم و β آنها يکسان و اما d_f و r متفاوت داشته باشند زمانهای بازداری در آنها تقريبا يکسان خواهد بود. اگر هدف جداسازی گونه های فرّار باشد از ستونهايی استفاده می شود که d_f بزرگتری داشته باشند. اگر غلظت گونه ها زياد باشد از گونه ای با d_f بيشتراستفاده می کنيم و بالعکس.

 طول ستون

با دوبرابرشدن طول ستون، کارايی آن دوبرابر می شود و رزولوشن 40% افزايش می يابد.

 

مشکلات ناشی از افزايش طول ستون:

1-افزايش زمان آناليز (دو برابر)

2-کاهش حساسيت

3-خروج فاز ساکن از ستون (دو برابر)

4-کاهش inertness ستون

انتخاب نوع فاز ساکن و همچنين ضخامت فيلم فاز ساکن از طول ستون اهميت بيشتری دارند.

حفظ ساختار ستون

-ضخامت لايه پلی ايميدی حداقل بايد 20-15 ميکرومتر باشد. برای جلوگيری از صدمه به اين لايه بايد ستون را در جاهای مخصوص نگهداری نمود.

-وقتی ستون را از داخل فرول گرافيتی عبور می دهيم، بايد بلافاصله چند سانتيمترابتدای ستون را بريد. اين عامل مانع ورود ذرات گرافيتی به ستون می شود.

-آلوده شدن ستون: وقتی ستون آلوده شود خط پايه کاملا ناپايدار می شود و از آن نمی توان برای اندازه گيری مقادير تريس استفاده کرد. مسئله ديگر جابجايی خروج گونه ها از ستون است.

راههای رفع آلودگی

 1-ستون را برای مدت معينی تحت دمای ماکزيمم (10 درجه پايين تر از دمای تحمل ستون) قرار می دهيم.

2-اگر آلودگی ها با دما از ستون خارج نشود حاکی از اين است که در ابتدای ستون جمع شده اند، بنابراين بهتر است 5/0 متر اول ستون بريده شود.

3-اگر باز هم مشکل حل نشد ستون را با حلال مناسب (ستون غيرقطبی را با هگزان و ستون با قطبيت متوسط را با متانل) شستشو دهيم.

روش شستشو: يک سر ستون را در داخل ظرفی (مانند ظرف پنی سيلين) حاوی حلال مورد نظر نموده و حلال را با فشار مثبت بوسيله سرنگ وارد ظرف می کنيم تا حلال از ستون عبور کند و آنرا شستشو دهد. سپس آنرا در در دمای محيط در مسير گاز حامل قرار می دهيم تا قسمت عمده حلال از آن خارج شود بعد دما را بتدريج افزايش می دهيم تا باقيمانده حلال از آن خارج شود.

                   

استفاده صحيح از ستون

با کمی توجه می توان عمر ستونها را افزايش داد لذا نکات زير بايد رعايت شوند:

1-در هنگاميکه گاز حامل در ستون جريان ندارد نبايد ستون را حرارت داد زيرا هوايی که احتمالا به درون ستون نفوذ کرده موجب تخريب فاز ساکن می شود.

2-همواره بايد از ورود اکسيژن به ستون جلوگيری شود، زيرا سريعا باعث تخريب فاز ساکن می شود. در مواقعی که از ستون استفاده نمی شود بهتر است دو سر ستون بسته باشد و همچنين از گاز حامل خالص استفاده شود.

3-وقتی بمدت طولانی از ستون استفاده نمی شود آنرا باز کرده و دو سر ستون را بوسيله سپتومهای مستعمل بسته و در جعبه مخصوص قرار دهيم.

4-هرگز پيشنهاد نمی شود که در دماهای پايين گاز حامل بمدت طولانی از ستون عبور داده شود، زيرا اين امر منجر به تجمع تدريجی ناخالصيها در ستون و آلودگی آن می شود.

 

فصل دوم HPLC

2-ستونهای کروماتوگرافی مايع

introduction to modern liquid chromatography. John Wiley and Sons, USA, 1979 L.R. Snyder, L.J.Kirkland.

در HPLC نيز ستون قلب دستگاه است. کيفيت جداسازی بيش از آنچه به کيفيت دستگاه وابسته باشد به کيفيت ستون بستگی دارد. همين عامل سبب می شود کيفيت ذرات ستون و شيوه پرکردن اين ذرات در ستون بر کارايی آن تاثير زيادی داشته باشد. عوامل موثر بر کارايی ستون عبارتند از:

1-سرعت جريان فاز متحرک

2-قطر ذرات پرکننده ستون d_p

3-ضريب نفوذ در فاز ساکن (Ds) و در فاز متحرک (D_m)

4-ضخامت فيلم فاز ساکن

5-وجود stagnant mobile phase (موثر بر پهن شدن پيکها)

اثر پارامترهای مختلف بر کارايی ستون در شکل 1-5 نشان داده شده است.

با کوچکتر شدن اندازه ذرات، ميزان تخلخل کاهش و قابليت ستون افزايش می يابد. بنابراين سعی می شود از ذرات با ابعاد خيلی کوچک استفاده شود. در پايين ترين نمودار در سرعتهای پايين، کارايی کم می شود که اين بدليل دخالت نفوذ طولی است.

برای افزايش کارايی ستون بايد نکات زير را مورد توجه قرار داد:

1-از ذرات پرکننده با ابعاد يکسان استفاده شود و سعی شود بطور دنس و محکم در ستون پر شوند.

2-ضخامت فيلم فاز ساکن تا حد امکان کوچک باشد.

3-از ذرات با ابعاد کوچک (10-3 ميکرومتر) استفاده شود.

Characteristics and use of different column packing

خصوصيات ستونهای مختلف و چگونگی تاثير آنها بر کاربرد نهايی در کروماتوگرافی مايع و همچنين انواع پرکننده ها به شکل تجارتی در دسترسند.

طبقه بندی پرکننده های HPLC

الف-از نظر سختی

1-پرکننده­های صلب و سخت

ساختار سيليکايی با تحمل فشار های psi 15000-10000، بيشترين کاربرد را در تهيه ستونها دارند و در شکلها، اندازه ها و تخلخلهای مختلف در دسترسند. می توان گروههای عاملی را در سطح آنها قرار داد و يا سطح آنها را با لايه های پليمری پوشاند.

2-ژلهای سخت

بيشترين کاربرد را در IEC و SEC دارند. معمولا از جنس پلی استايرن و دی وينيل بنزن هستند و قابليت تحمل فشارهای حداقل تا psi 5000 را دارند.

3-ژلهای نرم

آگارز و سفادکس که در Gel Filteration کاربرد دارند. قابليت تحمل فشارهای بالا را ندارند و بايد در فشارهای پايين از آنها استفاده کرد.

 

ب-از نظر تخلخل

1-بدون تخلخل (pellicular)

از ذرات بسيار ريز از جنس شيشه هستند که فاز ساکن را از طريق پليمريزاسيون در اطراف آن قرار می دهند. در حالت خاص سطح شيشه را توسط ذرات سيليکا می پوشانند تا پرکننده های با تخلخل سطحی ايجاد شود.

2-ذرات با تخلخل سطحی

3-ذرات متخلخل

 

ج-از نظر شکل فيزيکی

1-کروی

از طريق تهيه امولسيون سيليکا بدست می آيد. تحت اين شرايط ذراتی که ابعاد در حدود ميکرون يا انگستروم دارند به مرور زمان به هم می چسبند و ذرات کروی از محلول ته نشين می شود.

2-بدون شکل

معمولا از طريق رسوب دادن محلول آبی ساليسيليک اسيد، خشک کردن، خرد کردن و جداسازی دانه های با اندازه يکسان بدست می آيد.

 

د-از نظر اندازه

1-d_p<20µm

2- d_p>20µm

اندازه ذرات

معمولا می توان ستون را با ذرات با ابعاد يکسان پر نمود. تنوع اندازه نبايد بيش از 5/1 باشد. اگر ستون با ذرات يکنواخت پر نشده باشد از دو جهت مشکل ايجاد می شود. اولا موجب کاهش کارايی ستون و ثانيا افت فشار در ستون زياد خواهد بود. کارايی توسط ذرات بزرگ و افت فشار توسط ذرات کوچک تعيين می شود.

برای جداسازی ذرات با ابعاد يکسان در HPLC از سه سيستم استفاده می کنند:

1-solvent elutriation (در کتاب Karger توضيح داده شده است).

2-air classification (تونل باد)

3-cyclone separation (سيستم چرخانی که ذرات در جاهای مختلف برحسب ابعاد ته نشين می شوند.

ويژگيهای پرکننده های مختلف در جدول 2-5 کتاب آمده است.

 

 

ويژگيهای جداسازی

ذرات سخت و متخلخل بيشترين کاربرد را در HPLC دارند ولی تحت شرايط خاص ممکن است مجبور به استفاده از پرکننده های ديگر باشيم. لذا در مورد انتخاب پرکننده بايد چند عامل را در نظر گرفت:

1-کارايی ستون در مقابل نفوذپذيری يا افت فشار: اگر کارايی مدنظر باشد سعی می شود از ذرات متخلخل با ابعاد کوچک استفاده کنيم ولی فشار بايد افزايش يابد. اما اگر در اشل بزرگ کار کنيم يا کارايی خيلی بالا نياز نداريم پس بايد ظرفيت نمونه گذاری زياد شود و پمپ با فشار بالا نياز است. (شکل 8-5).

                

2-مقدار نمونه تزريقی و حساسيت اندازه­گيری: برای حساسيت بالا به نمونه زياد احتياج داريم، لذا به ذرات متخلخل نياز است. ولی اگر نمونه تزريقی کم باشد نياز به حساسيت بالا نداريم. پس می توان از ذرات بدون تخلخل استفاده کرد (شکل 9-5).

3-ابزار مورد نياز

4-راحتی استفاده از ستون: برای کار با بعضی از ستونها به فشار بالا و بعضی به فشار کم نياز است. استفاده از ستونی که به فشار کم نياز دارد راحت­تر است (جدول 3-5).   

برای محلولهای ساده که نياز به قدرت جداسازی بالا ندارند ذرات غيرمتخلخل مناسبتر است همچنين اين ذرات برای پرکردن ستونهای محافظ نيز بکار می روند. وقتی نياز به رزولوشن بالا باشد برای آناليز مقادير کم گونه ها نياز به ظرفيت بزرگ پيک است پس از سيستم ذرات کوچک استفاده می شود. وقتی از ذرات کوچک استفاده شود پهن شدگی داخل ستونی کاهش می يابد در نتيجه عوامل پهن شدگی خارج ستونی اثر خود را بيشتر نشان می دهند. لذا اگر از ذرات با ابعاد کوچک استفاده کنيم حجم های خارج ستونی مثل محفظه تزريق و دتکتور بايد کاهش يابد.

 

Available column packing

جداول 5-5 تا 13-5 فهرست پرکننده هايی را که امروزه بصورت تجارتی در دسترس هستند نشان می دهد. فهرست پرکننده­هايی را که قبلا استفاده می شدند اما اکنون کاربرد زيادی ندارند در ضميمه 1 آمده است. در جدول 4-5 نيز ويژگيهای پرکننده­های متخلخل و غيرمتخلخل مقايسه شده است.

 

End capped column

برای پوشاندن گروههای فعال از گروههای کوچک استفاده می شود به اين فرايند end capping گفته می شود. هرچه گروه پوشاننده کوچکتر باشد تعداد سايتهای بيشتری پوشانده می شوند. هرچه در صد carbon loading بيشتر باشد پهنای پيکها بيشتر خواهد بود.

R=C₁₈H₃₇  اکتا دسيل سيليکا است. مبنای نامگذاری همين گروه است.

شيوه های پرکردن ستونها

جنس ستون شيوه پرکردن آنرا مشخص می کند. ستونی که پر می شود بايد بگونه ای باشد که ذرات در آن به شکل يکنواخت پرشده باشند، دانه بندی مشخصی در آن اتفاق نيافتاده باشد، هيچ نوع شکستگی در هنگام پرکردن ذرات اتفاق نيافتاده باشد چون کارايی ستون را کم می کند و بر جداسازی اثر می گذارد، همچنين در آن کانالی وجود نداشته باشد زيرا موجب پهن شدن و دنباله دار شدن پيکها می شود. معمولا ذرات و ژلهای سخت را تحت فشار بالا وارد ستون می کنند ولی ژلهای نرم نبايد تحت فشار وارد ستون شوند.