سخت فزار ستون

جنس ستون می تواند بر کارايی آن اثر بگذارد. معمولا جنس ستون بايد بگونه ای باشد که بتواند فشارهای تا psi 10000 را تحمل کند و از نظر شيميايی نيز مقاوم باشد. معمولا ستونهای مورد استفاده از جنس استيل يا شيشه است (تحمل تا فشار psi 600). امروزه ستونهايی از جنس استيل ساخته می شوند که ديواره داخلی آنها از جنس شيشه است. اين ستونها کاربرد خاص دارند. معمولا سطح داخلی ستون بايد کاملا صيقلی باشد. از طرف ديگر فرولها و فيتينگهای مورد استفاده در ابتدا و انتهای ستون بايد دارای حجم مرده تا حد امکان کوچک باشند تا موجب پهن شدن پيکها نشوند. امروزه اين اتصالات با حجم مرده صفر در دسترس است (شکل 10-5). در ابتدا و انتهای ستون دو فيلتر استيل قرار می گيرد که ضخامت آنها cm 25/0 است و اندازه منافذ آنها طوری است که به ذرات پرکننده اجازه عبور نمی دهند.

Column dimension and configuration

از نظر ابعاد ستونها معمولا با طولهای cm 150-3 در دسترسند. ستونهای بزرگتر از cm 25 کمتر در معرض فروشند و اگر به ستونهای بزرگتر نياز باشد می توان چند ستون را بطور سری بهم متصل نمود. قطر داخلی ستونها از cm 9/0-0 است. هنوز رابطه مشخصی بين کارايی و قطر ستون ارائه نشده است ولی مطالعات کلی حاکی از اين است که با افزايش قطر ستون (تا حد mm 9) کارايی ستون افزايش می يابد. معمولا ستونهای با قطر cm 5/0-4/0 (قطرهای بهينه) بصورت تجارتی در دسترسند (شکل 11-5 ).

Dry-fill packing procedure for rigid solids

برای پرکردن ذرات بزرگتر از 3 ميکرومتر و پرکردن ستونهای محافظ از اين روش استفاده می شود. 1-ابتدا ديواره داخلی ستون با دی کلرومتان سپس متانل و نهايتا با آب شسته می شود تا چربيهای احتمالی موجود در داخل ستون حذف شوند.

2-در مرحله بعد برای اطمينان از شستشوی کامل، ديواره داخلی را با آب و يک دترجنت و برس شستشو داده و سپس با متانل می شوييم.

3-فيلتر خروجی ستون را می بنديم.

4-مقداری پرکننده به ستون می افزاييم بطوريکه mm 4-3 از ستون را پرکند. سپس در حاليکه ستون در حالت عمودی قرار دارد 100-80 مرتبه و معمولا با سرعت 3-2 بار در ثانيه ستون را روی لبه ميز می زنيم.

5-دوباره مقدار ديگری از پرکننده به ستون اضافه می کنيم و عمل زدن را تکرارمی کنيم. اين عمل را تا پرشدن کامل ستون ادامه می دهيم.

6-مدت 5 دقيقه ستون را به لبه ميز می زنيم تا زمانيکه سطح پرکننده داخل ستون تغيير نکند.

7-سپس فيلتر ابتدای ستون را می بنديم و ستون را در مسير فاز متحرک قرار می دهيم تا از آن عبور کند. اين کار را تا جايی ادامه می دهيم که از خروجی ستون غباری مشاهد نشود.

مشکل روش: بعضی مواقع سطح بعضی از ذرات، باردار شده و بطور محکم در ستون پر نمی شوند. لذا سعی می شود پرکننده را بمدت چند ساعت در محفظه اشباع از بخار آب قرار دهيم تا مشکل باردار شدن سطح از بين برود. امروزه برای پرکردن ستون بروش خشک عمل می شود بطوريکه پرکننده را در محفظه ای می ريزند و خود ستون را پرمی کند.

علت عدم استفاده از اين روش برای ذرات کوچک: وقتی از ذرات کوچک استفاده می شود انرژی به ازای واحد سطح زياد است و در نتيجه تعداد زيادی ذرات به هم می چسبند. وقتی اين ذرات را پرمی کنيم بصورت يک ذره بزرگ عمل می کنند و کارايی ستون را کاهش می دهند. لذا بهتر است از روش زير استفاده شود.

 

Wet-fill column packing methods

اين روش، روش دوغابی يا slurry-packing نيز نام دارد و برای ذرات غير متخلخل کمتر از 20 ميکرومتر و ذرات متخلخل کوچکتر از30 ميکرومتر بکار می رود. ابتدا ذرات را داخل حلال مناسبی خيس می کنند. اين حلال مانع چسبيدن ذرات به يکديگر می شود. سرعت ته نشينی در حلال از رابطه زير بدست می آيد:

                                       

V     سرعت ته نشينی

g     شتاب ثقل

r     شعاع ذره

ρ    دانسيته ذره

ρ₀   دانسيته حلال

η    ويسکوزيته

 

اگر ذراتی با دانسيته يکسان داشته باشيم اما شعاع آنها متفاوت باشد ذره ای که شعاع بيشتری دارد سريعتر ته نشين می شود. اين مسئله موجب دانه بندی در ستون می شود. برای جلوگيری از اين اتفاق سعی می شود دانسيته حلال به دانسيته ذرات نزديک باشد که به اين فرايند balance-density-slurry packing گفته می شود. اين موضوع در مورد ذراتی مطرح می شود که ابعادشان مساوی يا کوچکتر از 10 ميکرومتر است. در مورد ذرات مساوی يا کوچکتر از 5 ميکرومتر مشکل دانه بندی را نداريم زيرا دانسيته ذرات کاهش می يابد. اگر بخواهيم که در اين سيستم سيليکا يا سيليکايی که سطح آن با گروههای قطبی اصلاح شده پرکنيم سعی شود از حلال قطبی استفاده گردد. اما در صورتيکه بخواهيم سيستمهای reverse را پرکنيم از حلالهای غيرقطبی استفاده می کنيم. طبق رابطه فوق اگر از  حلالهای ويسکوز استفاده کنيم ستون بهتر پر می شود زيرا سرعت ته نشينی کمتر است ولی زمان طولانی خواهد شد. جدول 16-5 تعدادی از حلالهای مناسب برای پرکردن ستونها را نشان می دهد.

وقتی چنين ذراتی را می خواهيم پرکنيم ممکن است باردارشدن سطح ذرات مشکل ايجاد کند. لذا سعی می کنيم بهمرا حلال يک مقدار هم الکتروليت استفاده کنيم (مقداری نمک مانع باردار شدن می شود).

در روش دوغابی بايد نکات زير را رعايت نمود:

1-ذرات سوسپانسيون بهم نچسبند.

2-طی عمل پرکردن بايد ذرات به شکل معلق باقی بمانند و ته نشين نشوند.

3-بايد غلظت ذرات پرکننده متوسط باشد و باسرعت جريان خيلی زياد در ستون پرشوند.

4-حلال با پرکننده و ستون واکنش ندهد و براحتی از ستون خارج شود.

5-ذراتی که پرمی شوند بايد از استحکام لازم برخوردار باشند.

 

پرکردن ذرات سخت

برای اين کار می توان از دو تکنيک استفاده کرد:

1-down flow method: کاربرد زيادی برای پرکردن ستونها دارد. در اين سيستم ماده پرکننده تحت فشار های خيلی بالا داخل ستون پرمی کنند و ستون حاصله حاوی ذرات يکنواخت پرشده فاقد دانه بندی محسوسی است و ذرات بصورت فشرده وارد ستون شده اند. برای اينکه در اين سيستم فشارهای بالا اعمال شود از پمپی بنام Huskel pump  که پمپی ديافراگمی است و به کمک کپسول هوا کار می کند استفاده می شود (شکل 13-5).

جدول 17-5 فهرست حلالهای متداول را نشان می دهد.

             

 

طول ستونی که به اين روش پرمی شود به اندازه ذرات بستگی دارد. اين سيستم در حد psi 10000 است.

Lmax (cm)	dp (µm)
50	10-12
25	7-8
10-15	5-6

 

2-up flow method: ستونهايی که به اين شيوه پر می شوند از نظر کارايی هيچ اختلافی با آنهايی که از روش اول پر می شوند ندارند. اين روش برای ستونايی با طول بزرگتر از cm 25 بسيار مفيد است. حتی ستونهای بطول يک متر با ذرات 3 ميکرومتر نيز با اين روش پر شده اند (شکل 14-5). فشار در اين سيستم در حد psi 2000 است.

پرکردن ژلهای نرم و سخت:

1-down flow method:

2-up flow method:

 

تفاوتها نسبت به پرکردن ذرات سخت:

1-قبل از پرکردن ژل در ستون مدت مشخصی اجازه می دهند تا ژل داخل حلال خيس بخورد.

2-در اين روش برای پرکردن از حلال با دانسيته کم مثل مخلوط استن و پرکلرواتيلن استفاده می شود.

3-فشار مورد استفاده پايين است.

 

معمولا فشاری که سيستم می تواند تحمل کند به cross-linking بستگی دارد و ماکزيمم تحمل فشار psi 5000 است. برای پرکردن ژلهای نرم نه از روش خشک و نه از روش دوغابی استفاده می کنيم بلکه اينها را داخل حلال مناسبی قرار می دهيم تا براثر نيروی وزن ته نشين شوند و داخل ستون را پرکنند.

 

Column evaluation and speciation

پس از اينکه ستونی تهيه يا خريداری شد لازم است از نظر کارايی ارزيابی شود.

1- تعداد بشقابکهای تئوری N: در حالت معمول کارايی ستون از روی تعداد بشقابکهای تئوری مشخص می شود. N برای گونه های با k'=0,3,10 تعيين می شود. برای محاسبه N ابتدا آنرا بکمک سه گونه محاسبه می کنيم. اگر برای جزء اول مقدار آن به شکل قابل ملاحظه ای با دو گونه بعدی متفاوت باشد در آنصورت می توان حدس زد عوامل بيرونی ستون نقش مهمی در پهن شدن باندها دارند پس بايد موانع بيرون ستون را حذف کنيم بعد ستون را مجددا ارزيابی کنيم.

2-مقدار k' برای گونه های موردنظر

3-مقدار α برای دسته ترکيبات غيرمشابه

4-تقارن پيک: شکل پيک معيارمناسبی از کارايی ستون است. وجود دنباله در پيکها بيانگر تاثيرات متقابل گونه با گروههای سيلانول آزاد است. برای مطالعه تقارن پيک از پارامتر peak asymmetry factor استفاده می کنيم. درصورتيکه مقدار اين فاکتور بزرگتر از 2/1 باشد Nبدست آمده بزرگتر از مقدار واقعی خواهد بود (جدول ص 223).

5-ميزان افت فشار برای سرعت جريانهای معين

6-غلظت فاز پيوندی (carbon loading)

اگر بخواهيم مطالعات اساسی انجام دهيم ممکن است لازم باشد پارامتری مثل h و v (سرعت جريان کاسته) يا مقاومت ستون در برابر عبور جريان φ يا knox-patcher ratio هم موردنياز باشد.

هر چه φ کوچکتر باشد بهتر است                      

k₀:     column specific permeability

   knox-patcher ratio                             

تابع τ  

U2, U3=2^nd & 3^rd central moments of peaks

فاکتور PAF و فاکتور γ' ميزان انحراف از مقدارR  را نشان می دهند. بر اساس معيارهای ذکرشده اگر بخواهيم ستونی را انتخاب کنيم اين ستون بايد دارای چه ويژگيهايی باشد؟

 

مشخصات ستون خوب:

1-  اگر ستون خوب باشد، برای سرعت کاسته ، بهتر است ارتفاع کاسته  در محدوده 2 باشد و اگر سرعت کاسته را تا 100 افزايش دهيم h نبايد بزرگتر از 100 شود (h<100).

2-   مقدار مقاومت ستون در برابر عبور جريان، φ، بايد کمتر از 1000 باشد.

3-  برای ستونی با طول cm25 و ، اگر ν=0.08cm/s آنگاه N=10000 و برای ستونی که طول آن cm 15 و  است در صورتيکه ν=0.15cm/s باشد N=12000 خواهد بود. (اين ستونها بيشترين کاربرد را دارند).

4-  معمولا مقدار N پيش بينی شده توسط کارخانه سازنده برای ستون در عمل دسترس پذير نيست، زيرا آنها تحت بهترين شرايط بدست آمده اند. اما N بدست آمده نبايد کمتر از 50% مقدار گزارش شده توسط کارخانه سازنده باشد.

5-   PAF<1.2 باشد که اين ايده ال ترين حالت است اما اگر کمتر از 6/1 هم باشد قابل قبول است.

6-   تغييرات α و k' برای يک گونه مشخص در ستون نبايد بيش از 5% ± و 10% ± باشد.

7-  اگر N بدست آمده برای ستون خيلی کوچکتر از مقدار گزارش شده توسط کارخانه سازنده باشد لازم است ابتدا اثرات پهن شدگی خارج ستون ارزيابی شود. اگر اين اثرات قابل ملاحظه نباشند در اينصورت ستون مشکل دارد و بايد عودت شود.

 

Column techniques

نحوه برخورد با ستونها: برای حفظ کارايی، ظرفيت پيک و نفوذپذيری ستونهايی که اندازه ذرات پرکننده آنها کمتراز µm 10 است لازم است يک سری مسائل رعايت شوند:

1-  تمام حلالها و بخصوص بافرها قبل از استفاده بکمک فيلتر خاصی صاف شوند (نمونه های آبی از فيلتر استات سلولز و مواد آلی از فيلترهای نايلونی و تفلونی که اندازه منافذ آنها µm2/0 است).

2-  اگر از بافر استفاده می کنيم (بافرها بعد از مدتی که می مانند در آنها يک سری رشته ها که ناشی از وجود توده های قارچ است تشکيل می شود) مقدار جزئی از (01/0%) NaN3 به آن اضافه می شود تا از تشکيل توده های قارچها جلوگيری شود.

3-   از تکان دادن شديد، وارد کردن ضربه و قرار دادن ستونها در دماهای بالا خودداری شود.

4-   حداکثر فشار مجاز برای عبور فاز متحرک از داخل ستون، بايد 50% فشاری باشد که ستون تحت آن پرشده است.

5-  اگر در آغاز استفاده از ستون مشخص شود پيکها خيلی پهن هستند می توان ابتدای آن را بازکرده و نگاه کنيم. در صورت وجود فضای خالی در ابتدای آن، معلوم است که خوب پرنشده است. اما اگر بعد از مدت زيادی استفاده و متوجه شديد ابتدای آن خالی شده اول بايد آنرا از ذرات ريز شيشه يا همان پرکننده پُرکنيم.

Backflushing6-  

يکی از روشهای مورد استفاده در LC است که در آن ابتدا جداسازی را در يک جهت انجام می دهيم و بعد از مدت زمان معينی جهت آنرا عوض می کنيم. بکمک اين سيستم می توان رزولوشن را تنظيم شده نگه داريم. روی هر ستون فلشی است که جهت جريان را نشان می دهد. اين همان جهتی است که ستون در آن جهت پرشده است. برای جريان معکوس نبايد سرعت خيلی زياد باشد. در LC از اين روش زياد استفاده می شود. اين روش هم زمان را کوتاه می کند و هم رزولوشن را بهبود می بخشد.

7-وقتی می خواهيم ستون RP را برای مدت زيادی نگهداری کنيم معمولا داخل آنرا با حلال مناسبی پرمی کنيم.

8-استونيتريل حلال مناسبی برای نگهداری ستونها محسوب می شود.

9-اگر داخل ستون آب باشد نبايد pH آن خارج از محدوده 5/8-2 باشد.

مشکلات ستونها

1-اگر در آغاز استفاده از ستون، درابتدای آن حفره ای ايجاد شود اين ستون مناسب نيست و بايد به فروشنده عودت شود.

2- اما اگر بعد از مدت مشخصی در ابتدای آن حفره ايجاد شود بايد آنرا پر کنيم تا کارايی کاهش بيشتری پيدا نکند.

3-مشکل ديگر افزايش فشار ستون است که بعد از مدتی ايجاد می شود. اين مشکل معمولا مربوط به قرار گرفتن ذرات داخل لوله ورودی ستون يا گرفتگی فيلتر ابتدای ستون است. اين ذرات از نمونه هايی حاصل می شوند که صاف نشده باشند يا اگر از سرنگهای مناسب برای تزريق استفاده نشده باشد ممکن است خراشهايی در شير تزريق ايجاد شود و اجزائی را ايجاد کند که به ابتدای ستون برسند و موجب گرفتگی آن شوند.

(سرنگهای HPLC با سرنگهای GC تفاوت دارند. سوزن سرنگ در GC حالت N دارد و تيز است تا بتواند سپتوم را بشکافد اما سوزنهای HPLC تيز نيستند. استفاده از سرنگ GC موجب خراش در rotor می شود. پس بايد سعی شود از سرنگهای خاص HPLC استفاده شود. در صورتيکه گرفتگی ايجاد شود بايد ابتدای ورودی ستون را باز کنيم و محفظه فرول را تميز کنيم و اگر باز نشد فيلتر را بيرون آورده و تميز کنيم و بايد دقت شود که پرکننده دست نخورد.

4-مشکل بعدی اين است که پرکننده ساختار سيليکايی دارد که در آب تاحدی محلول است. حضور نمکها در فاز متحرک انحلال اين فاز را شتاب می دهد و معمولا اين انحلال در pH>8 خيلی سريع رخ می دهد. برای افزايش عمر ستون بايد سعی شود حتی الامکان از بافرها کمتر استفاده شود و جداسازی را در pHهای 2 تا 8 انجام دهيم و بالاخره حتما قبل از ستون اصلی از يک ستون محافظ استفاده شود (اين کار عمر ستون را بشدت افزايش می دهد).

 

اتصال سری ستونها

بعضی مواقع به ستونهايی نياز داريم که ظرفيت پيک آنها زياد باشد (زمانی که اجزاء يک مخلوط پيچيده را می خواهيم جدا کنيم). ممکن است ستونی با طول يک­متر هم وجود داشته باشد اما زياد در دسترس نيست. لذا به جای استفاده از ستون بلند می توانيم چند ستون را بطور سری بهم وصل کنيم. در اتصال اين ستونها به هم سعی شود حجم مرده آنها خيلی کوپک باشد. در صورتيکه چند ستون را بطورسری وصل کنيم کارايی ستون يا N از رابطه زير قابل محاسبه است.

                                           

Y  تعداد ستونها

Ni تعداد بشقابکهای تئوری هر ستون

Nt تعداد کل بشقابکهای تئوری

 

وقتی با اين رابطه N را محاسبه می کنيم، يک بار هم N را بصورت عملی N_obs)) بدست می آوريم. N_obs  هميشه بيشتر از N محاسبه شده است (جدول 22-5) چرا؟

وقتی تعداد ستونها زياد می شود نسبت حجم مرده کل به حجم ستونها کاهش می يابد. لذا اين باعث افزايش N_obs  می شود.

Guard columns

در LC بسيار اتفاق می افتد که نمونه مجهول با فاز متحرک مورد استفاده، از ستون خارج نشود. برای رفع اين مشکل ممکن است غلظت را اضافه کنيم و يا حلال را عوض کنيم اما باز هم سيگنالی مشاهده نشود. پس تزريق مکرر نمونه هايی که از ستون خارج نمی شوند ممکن است منجر به تغيير تدريجی رفتار ستون شود. قرار دادن ستون محافظ قبل از ستون اصلی موجب جذب نمونه های مزاحم خواهد شد. همچنين ذرات موجود در فاز متحرک می تواند در ستون محافظ نگهداری شده و مانع گرفتگی ستون اصلی شود. لذا استفاده از ستونهای محافظ برای افزايش عمر ستون اصلی پيشنهاد می شود. نقش مهم ديگر ستون های محافظ اين است که اگر فاز متحرک سيليکای ستون را حل کند با اين کار حلال با فاز ساکن ستون محافظ اشباع شده و هنگامی که وارد ستون می شود فاز ساکن ستون اصلی حل نمی کند.

معمولا طول ستونهای محافظ در حد cm10-5 است. پرکننده اين ستونها معمولا از جنس ستون اصلی است. نوع ذرات پرکننده pellicular  است و به روش خشک پر می شود. اين ستونها به دو روش پر می شوند:

1-کارتريج

2-پرشونده

 

سوال: وقتی قبل از ستون اصلی، از ستون محافظ استفاده می کنيم آيا کارايی ستون به مقدار قابل ملاحظه ای عوض می شود؟ همانطوريکه می دانيم اندازه ذرات پرکننده ستون محافظ در حد µm20 و ستون اصلی µm5 است. مطالعات نشان می دهد که فقط برای ترکيباتی که k'=0 است N به شکل قابل ملاحظه ای عوض می شود و برای ترکيباتی که k' بزرگ دارند N تحت تاثير قرار نمی گيرد (جدولهای 23-5 و 24-5).

Column "infinite-diameter and wall effects"

حالتی را در نظر می گيريم که پهن شدگی عرضی در ستون رخ دهد. اگر پهن شدگی عرضی طوری اتفاق بيافتد که نمونه به ديواره ستون برسد چون سرعت جريان فاز متحرک در ديواره ها تقريبا صفر است در اينصورت پهن شدگی عرضی، پهن شدگی طولی را بشدت تحت تاثير قرار می دهد و پيکها بسيار پهن خواهند شد. برای جلوگيری از اين مشکل ممکن است پيشنهاد کنيم از ستونهای با قطر زياد استفاده شود تا هرگز نمونه به ديواره ستون نزديک نشود. اگر اين کار را انجام دهيم حجم های پرکننده، فازمتحرک مصرفی و نمونه زياد می شود. برای رفع اين مشکل و استفاده از ويژگيهای ستونهای با قطر زياد، گونه ها را درست به قسمت مرکزی ستون تزريق می کنيم. به اين منظور از frit استفاده می شود (frit باعث می شود نمونه به قسمت مرکزی ستون تزريق شود). با توجه به اينکه پهن شدگی عرضی کم است با حرکت نمونه در داخل ستون هرگز به ديواره ها نمی رسد. به اين نوع ستون "infinite-diameter and wall effects" گفته می شود.

مثال: اگر ستونی بطول cm 10 و قطر ذرات µm5 باشد، پهن شدگی عرضی در ستون cm 25/0 است. معمولا از ستونهايی استفاده می شود که قطر آنها mm6/4 است.

برای پيشگويی شرايطی که تحت آن به اين صورت عمل می شود از رابطه زير استفاده می کنيم:

ν سرعت جريان خطی (cm/s)

برای اين منظور طول ستون و قطر ذرات پرکننده  بايد کوچک، و d_c و ν تا حد ممکن بزرگ باشند. مطالعات نشان می دهند که اگر dp≤5 باشد به دليل کوچکی پهن شدگی عرضی حتی اگر نمونه را به مرکز ستون تزريق نکنيم از مزيت "infinite-diameter and wall effects" برخورداريم. اين مشکل زمانی پيش می آيد که اندازه ذرات ستون بزرگ باشد زيرا از تمام ذرات پرکننده ستون نمی توان استفاده کرد. ظرفيت نمونه گذاری را بشدت کاهش می دهد لذا اين سيستم در کروماتوگرافی تهيه ای چندان مناسب نيست. در کروماتوگرافی تهيه ای از قسمتهای مختلف تزريق انجام می شود (و نه صرفا از مرکز ستون). لذا در سيستم تهيه ای سعی نمی کنيم از اين روش استفاده کنيم.

 

Limits of column performance

ممکن است اين سوال پيش آيد که فشار مناسب برای کار با ستونها در چه محدوده ای است؟

مطالعات نشان می دهند که هر چه φ بالاتر رود، کارايی (N) کاهش می يابد. معمولا برای رسيدن به N مناسب توصيه می شود φ<1000 باشد.

سوال دوم: در ستونهای LC اندازه ذرات پرکننده در چه محدوده ای باشد تا بالاترين کارايی حاصل شود؟ اندازه ذرات به فشار موردنظر برای عبور دادن فاز متحرک از ستون و همچنين زمان جداسازی بستگی دارد. اثر اين پارامترها در جدول 25-5 نشان داده شده است. طبق اين جدول اگر کار در فشار psi 5000 برای جداسازی در محدوده min 15-5/1 رخ دهد اندازه بهينه ذرات در حد µm2-1 است. هرچه زمان جداسازی افزايش يابد اندازه ذرات نيز افززايش می يابد زيرا سرعت بهينه کم می شود. معمولا ستونهايی که با ذرات µm3-2 پر شده اند از لحاظ N و زمان جداسازی جزو بهترين ها محسوب می شوند.

ويسکوزيته مناسب فاز متحرک چه مقدار است؟

هر چه ....فاز متحرک کم شود و کارايی ستون ......

حداقل حجم مرده قابل قبول برای سيستم HPLC چقدر است؟

جدول 27-5 حجم پيکها را تحت دو فشار 500 و 5000 برای ذرات با ابعاد µm5-2 نشان می دهد. خود ستون باعث پهن شدن می شود پس کروماتوگرام حجمی دارد. اگر حجم مرده سيستم نسبت به آن کوچک باشد حجم مرده مشکل ايجاد نخواهد کرد. طبق اين جدول حداقل حجم کروماتوگرام 140 ميکروليتر است. وقتی ذرات بزرگتر از µm5 باشند حجم مرده خيلی بزرگتر از اين است و تاثير خيلی زيادی بر کارايی نخواهد داشت ولی اگر ذرات µm3-2 باشند حتما لازم است توجه جدّی به حجم مرده داشته باشيم.

 

Solvents

کيفيت جداسازی بستگی به نوع ستون و نوع فاز متحرک دارد. فاز متحرکی که استفاده می شود بايد چند ويژگی اساسی داشته باشد:

1-مطابقت با نوع ستون (مثلا اگر ستون RP باشد فاز متحرک بايد غيرقابل امتزاج با فاز ساکن باشد پس حلال غيرقطبی استفاده شود در غيراينصورت هيچ جداسازی رخ نخواهد داد.

2-مطابقت با نمونه (بتواند نمونه را در خود حل کند تا آنرا در ستون بحرکت درآورد).

3-مطابقت با آشکارساز (مثلا اگر آشکارساز مورد استفاده UV-Vis. است حلال در آن ناحيه شفاف باشد و يا اگر آشکارساز از نوع الکتروشيميايی است حلال فاز متحرک در ولتاژ اعمال شده نبايد فعال باشد).

 با توجه به اينکه تعداد حلالهای در دسترس بسيار زياد است برای انتخاب حلال نياز به طبقه بندی آنها داريم. در شکل 1-6 نحوه انتخاب حلال مناسب برای LC توضيح داده شده است. تمام حلالها در يک مثلث آمده است. تعداد زيادی از حلالها (شايد حدود 90% آنها) بدليل نامناسب بودن خواص فيزيکی مانند نقطه جوش، ويسکوزيته، ايمنی و ... در HPLC غيرقابل استفاده اند. در مرحله دوم حلالها يا مخلوطهايی را استفاده می کنيم که 2≤5 برای نمونه های دو جزئی و 0.5≤k'≤20  برای نمونه های .... را در اختيار قرار می دهند. تعداد ديگری از حلالها بدليل نامناسب بودن k' حذف می شوند. بالاخره در HPLC از حلالهايی استفاده می کنيم که α مناسبی داشته باشند پس تعداد ديگری از حلالها به دليل نداشتن α مناسب حذف می شوند. بنابراين تعداد حلالهای مناسب برای    HPLC به حدود 1% کل حلالها کاهش می يابد.

خصوصيات يک حلال مناسب برای  HPLC

1-دسترس پذيری

2-سازگاری با آشکارساز (در جدول 1-6 فهرست حلالهای مناسب برای آشکارسازهای UV-Vis و ضريب شکست آمده است).

3-فعاليت حلال: حلال نبايد نسبت به گونه و فاز ساکن برهم کنش داشته باشد. همين عامل موجب حذف حلالهای آلدئيدی، الفينها و ترکيبات گوگردی بجز DMSO می شود. حلالهای کتونی و نيترو نيز کاربرد کمی دارند.

4-ويسکوزيته و نقطه جوش حلال: معمولا اين دو خاصيت در يک جهت عمل می کنند (جدول 1-6). توصيه می شود نقطه جوش حلال 50-20 درجه بالاتر از دمای جداسازی باشد. همچنين توصيه می شود مقدار ويسکوزيته در دمای جداسازی کمتر از 5/0 سانتی پواز باشد. حلالهای با ويسکوزيته کم کارايی را افزايش می دهند. ولی استفاده از حلالهای کم ويسکوز مشکل عمده ای دارد و آن اينکه سريعا ايجاد حباب می کنند و کار پمپ را مشکل می کنند. معمولا توصيه می شود از مخلوط حلالها استفاده شود. يک حلال با ويسکوزيته پايين و حلال ديگر با ويسکوزيته بالا. ويسکوزيته کل توسط حلال با ويسکوزيته کم تعيين می شود. با اينکار مشکلات پمپ مرتفع می شود (جدول ص 253). ويسکوزيته خيلی نزديک به حلال با نقطه جوش کمتر است.

5-miscibility: اگر از مخلوط حلالها استفاده می کنيم لازم است حلالها امتزاج پذير باشند و از طرف ديگر سيستم حلال استفاده شده با فاز ساکن غيرقابل امتزاج باشد. (در جدول 2-6 فهرست حلالهای بکاررفته در HPLC و امکان امتزاج پذيری آنها آمده است).

6-ايمنی (از نقطه نظر سميّت و اشتعالپذيری): متاسفانه اکثر حلالهای HPLC سميت قابل ملاحظه ای دارند به همين دليل بايد سعی شود از حلالهای با سميت کم استفاده شود و در تماس مستقيم آنها قرار نگيريم. بعضی از حلالها نيز اشتعالپذيرند که در هنگام کار با آنها بايد دقت کافی شود.

معمولا فاز متحرک می تواند از طريق 4 نوع نيرو تاثيرات متقابل داشته باشد.

1-پراکندگی

2-دوقطبی-دوقطبی

3-پيوند هيدروژنی

4-يون-دوقطبی

توانايی حلال برای ايجاد تاثيرات متقابل با گونه توسط اين نيروها معياری از پلاريته است. ممکن است در سيستمی افزايش پلاريته منجر به کاهش زمان جداسازی يا افزايش زمان جداسازی شود. در سيستم RP و NP. در RP (مثلا آب-متانل که در اينجا آب حلال پلار است) هرچه پلاريته فاز متحرک بيشتر شود زمان طولانی تر می شود و در مورد NP (مثلا هگزان –دی کلرومتان که در اينجا دی کلرومتان حلال پلار است) برعکس است.

در مورد پلاريته حلالهای خالص معيارهای مختلفی برای اندازه گيری وجود دارد يکی از مهمترين روشها روش Rohrschneider است.

رفرنسهای مربوط به روش Rohrschneider:

1. L. Rohrschneider anal. Chem.. 45(1973)124.

2. L. Rohrschneider chromatography, 92(1974)223.

3. L. Rohrschneider J. Chromatography Science 16(1978)233

4. Karger book.

جدول 1-6 مقادير پلاريته محاسبه شده توسط Rohrschneider  را نشان می دهد پلاريته اين محلولها در محدوده (آب)  -2≤P≤10.2 (فلوروهيدروکربنها) است.

پلاريته حلال پارامتر بسيار مهمی است که حتما می تواند تاثير شديدی بر k' و حلال داشته باشد. مطالعات نشان می دهندکه اگر پلاريته به اندازه دو واحد تغيير کند مقدار k' به ميزان ده برابر تغيير می يابد. در RP عکس اين حالت رخ می دهد.

مثال: در يک ستون RP يک گونه دارای زمان بازداری 3/31 دقيقه است. گروههای بازداری نشده در زمان 48/0 دقيقه از ستون خارج می شوند. در اين سيستم فاز متحرک دارای نسبت حجمی 30:70 متانل:آب است. الف) مقدار k' را محاسبه کنيد. ب)نسبت آب: متانل را بطوريکه k' را به 5 منتقل کند محاسبه کنيد.

 k'₁=64                      k'₂=5                          P₂=6.6

با توجه به اين پلاريته درصد هر يک از حلالهای متانول و آب را مشخص کنيد.

 

انتخابگری حلال

پلاريته را طوری تنظيم می کنيم که 2≤k'≤5 باشد. در اين حالت اغلب موارد جداسازی ها کامل است و تحت بعضی شرايط همپوشانی پيش می آيد. در چنين شرايطی لازم است بدون تغيير در k' مقدار α را تغيير دهيم. بدين منظور در مخلوط حلال يک حلال را توسط حلال ديگری جايگزين می کنيم تا در شرايط قطبيت ثابت بتواند برهم کنشهای متفاوتی با گونه ايجاد کند. در نتيجه گزينش پذيری نهايی را بهبود بخشد. اين بحث بيشتر در مورد NP صادق است. اگر حلالی داشته باشيم (سيستم هگزان+متانول) و مشاهده کرديم که k' در محدوده بهينه است ولی جداسازی کامل نيست. پس حلال قطبی را که از طريق پيوند هيدروژنی برهم کنش می کند برمی داريم و حلال ديگری که پيوند هيدروژنی تشکيل ندهد را جايگزين آن می کنيم. حال برای اينکه پلاريته بهم نخورد بايد مشخص کنيم که از هر حلال جند درصد استفاده کنيم. لازم بذکر است که در سيستم جديد نبايد پلاريته اوليه بهم بخورد. چون حلال پايه در اينجا هگزان (غيرقطبی) است نبايد آن را عوض کنيم.

مثال: اگر در مخلوط هگزان:کلروفرم بانسبت 75:25 ، کلروفرم را (که از طريق برهم کنشهای دوقطبی-دوقطبی و دهندگی H عمل می کند) با دی اتيل اتر عوض کنيم:

چگونه حلال را عوض کنيم تا انتخابگری را بهبود بخشيم؟ برای اين که راه حل عملی داشته باشيم حلالها را برمبنای گزينش پذيری مرتب می کنند.

Classification of solvent selectivity

درصورتيکه ترکيب حلال را بگونه ای عوض کنيم که نوع برهم کنش عوض شود α تغيير می يابد. اگر مخلوط متانل + هگزان داشته باشيم و آنرا با اتانل+هگزان عوض کنيم انتخابگری خيلی عوض نمی شود زيرا نوع برهم کنش هردو حلال از طريق پيوند هيدروژنی است. اما اگر با دی کلرومتان عوض کنيم انتخابگری بشدت عوض می شود پس اگر اطلاعاتی در مودر ماهيت برهم کنش حلال-گونه داشته باشيم می توانيم حلال مناسب را برای کار انتخاب کنيم. برای اين منظور می توانيم از پارامترهای پلاريته Rohrschneider  استفاده کنيم. در صورتيکه پارامترهای مذکور را در گوشه های يک مثلث درنظر بگيريم 8 دسته حلال برمبنای انتخابگری حاصل می شود (شکل ص 263).

 

A systematic approach to selectivity optimization

اگر فرض کنيم سيستم حلال هگزان+کلروفرم با نسبت حجمی 20:80 دارای k' بهينه باشند پلاريته اين حلال برابر با 88/0 خواهد بود. فرض کنيم اين نسبت انتخابگری مناسبی ندارد و پيکها درهم ادغام می شوند. حال α را بايد عوض کنيم. ابتدا به جدول 1-6 مراجعه می کنيم و گروه کلروفرم را پيدا می کنيم. سپس سراغ جدول می آييم. اگر بخواهيم α را عوض کنيم بايد حلالی را انتخاب کنيم که بشدت از آن دور است (مانند گروههای 1 و5). از اين دو گروه می توانيم يک حلال انتخاب کنيم (دی کلرومتان يا اتيل اتر). در اينجا دسترس پذيری مهمتر است فرض کنيد دی کلرومتان را انتخاب کنيم:

کسر مولی سيستم جديد:                         

 

اگر α مناسب نبود نبايد حلال ديگری را از اين گروه انتخاب کنيم. پس بايد گروه را عوض کنيم. اگر حلال پايه را عوض کنيم α عوض خواهد شد؟

برهم کنشهای هگزان بسيارضعيف است. به جای هگزان از يک حلال غيرقطبی ديگر مانند CS₂ يا سيکلوهگزان استفاده کرد ولی تاثير زيادی در مقدار α ندارد. اما مطالعات انجام شده نشان می دهد در جداسازی گونه های غيرقطبی با ضريب شکستهای متفاوت انتخاب حلالی با ضريب شکست متفاوت نتايج مثبتی ارائه می کند. هرچند تغييرات شديد نيست اما می تواند بهبودی در α ايجاد کند. علی ايحال تغييرات جدی فقط توسط حلال قطبی ايجاد می شود.

 

CS2	سيکلوهگزان	هگزان	حلال
624/1	404/1	372/1	ضريب شکست

 

Solvent selection in RP

در اينجا فاز متحرک متشکل از آب و يک حلال با قطبيت کم مانند متانل، استونيتريل، THF و ... است که با آب قابل امتزاج است. در اين سيستم حلال پايه آب است و برای تغيير α حلال با پلاريته کم را بايد عوض کنيم. در حاليکه چنين تغييری تاثيرات جدی بر α نخواهد داشت ولی اگر بخواهيم آنرا عوض کنيم ترکيب درصد حلال جديد از اين رابطه قابل محاسبه است.

 با توجه به اينکه عددی که بدست می آيد خيلی تقريبی است پارامتر ديگری بنام S تعريف شده که با آن کسر حلال را دقيقتر می توان بدست آورد.

برای حلالهای مختلف مقدار S در جدول زير آمده است:

THF	1-propanol	EtOH	Dioxane	Acetone	ACN	MeOH	H2O	solvent
4.4	4.2	3.6	3.4	3.4	3.1	30	0.0	S

 

مثال: اگر فاز متحرک مخلوط 50:50 متانل-آب باشد و بخواهيم برای تغيير α فاز متحرک را به سيستم THF:آب تغيير دهيم کسر حجمی THF را حساب کنيد.

خالص سازی حلالها

بيش از 85% جداسازی در سيستم HPLC با RP انجام می شود. در اينجا حلال بنيادی آب است. هرچند آب با درجه خلوص HPLC در دسترس است اما بهتر است در آزمايشگاه تهيه شود. در شرايطی که از ستونهای محافظ استفاده می شود می توان از آبهای دی آيوناِيزد استفاده کرد و فيلترهای 2/0 تا 45/0 ميکرومتر را بکار برد. عبور از ذغال اکتيو نيز کيفيت را بهبود می بخشد. شرکت ميلی پور ابزار تهيه آب HPLC را بفروش می رساند.

دسته دوم حلالها هيدروکربنهای آليفاتيک هستند که بستر NP را تشکيل می دهند. ناخالصی معمول اين حلالها هيدروکربنهای سيرنشده است که در پايين تراز 260 نانومتر جذب دارند. برای خالص سازی اين حلالها می توان آنرا از سيليکای حاوی نيترات نقره عبور داد. برای اين منظور سيليکا را به داخل محلول حاوی 10% وزنی/حجمی نيترات نقره می ريزيم. کاملا بهم زده و درحين هم زدن حلال را تبخير می کنيم سپس آنرا در دمای 125 خشک می کنيم و ذرات حاصل را داخل ستون پر می کنيم. با عبور حلال از موردنظر از چنين ستونی می توان هيدروکربنهای سيرنشده را از آن خارج کنيم.

حلال ديگری که کاربرد دارد reagent grade ether است. معمولا اتری که در آزمايشگاه موجود است حاوی پايدارکننده آنتی اکسيدان است که BHT نام دارد. اين ترکيب در UV جذب دارد ولی با توجه به اينکه ترکيب سنگينی است اگر حلال را يکبار تقطير کنيم می توان از آن برای HPLC استفاده کرد.

حلال ديگر کلروفرم است که خيلی پردردسر است. معمولا پايدارکننده های آن يا از نوع اتانل يا آميلن است. اين حلال اگر مدتی باقی بماند عليرغم وجود پايدارکننده ها عواملی مانند ^.CH3  و ^.Cl و HCl در آن بوجود می آيد. اگر کلروفرم را از استيل عبور دهيم بخارسبز رنگی از آن خارج می شود که اين بخاطر وجود HCl است که کروم را حل می کند و اين بخار سبزرنگ را توليد می کند. حتما سعی شود کلروفرمی که مصرف می شود از تاريخ توليد آن بيش از حداکثر دوسال نگذشته باشد.

برای خروج پايدارکننده در صورتيکه الکل باشد می توان آنرا بکمک آب استخراج نمود وسپس با سديم سولفات بی آب کلروفرم حاصل را خشک کنيم و در صورتيکه آميلن باشد از طريق تقطير آنرا جدا کنيم. از طرف ديگر اگر حلالی مانند کلروفرم و ساير حلالهای هالوژنه داشته باشيم که مدتی مانده باشند و عوامل فوق در آن توليد شده باشند برای خروج اين عوامل می توان آنرا از روی آلومينای بازی عبور دهيم. در کل حلالهای مورد استفاده در HPLC  بايد خشک باشند. برای خشک کردن حلالها بهترين شيوه استفاده از زئوليتهای مولکولار سيو 4Å است. حلال را تماس قرار می دهيم آب جذب می شود.

 

LC/MS

 LC/MS بخصوص در زمينه سيستمهای حياتی کاربرد زيادی پيدا کرده است. ابتدا در مورد MS صحبت می کنيم (رفرنس آخرين ويرايش کتاب اسکوگ).

طيف جرمی از تبديل مولکولهای گازی به يونهای گازی و جداسازی آنها برمبنای m/z حاصل می شود. بين ابزار تجزيه ای شايد MS پرکاربردترين سيستم است.

چرا MS در تمام شاخه های علوم کاربرد زيادی دارد؟

1-قادر است اطلاعات کمی و کيفی در مورد آناليتهای معدنی و آلی در مخلوطهای پيچيده را فراهم کند.

2-ساختار مولکولهای پيچيده را تعيين می کند.

3-نسبت ايزوتوپی اتمها را در نمونه مشخص می کند. اين کار از چند جهت اهميت دارد. يکی از اين زمينه ها تعيين طول عمر (dating) است. برای اين کار ²³⁵U/²³⁸U را می سنجند. يا در سيستمهای isotope enrichment استفاده می شود.

4-اطلاعاتی در مورد ساختار و ترکيب سطوح در اختيار قرار می دهد.

5-تغيير جرم اتمی يا جرم مولکولی برحسب دالتون يا amu

 عدد جرمی متوسط ايزوتوپها

 فراوانی ايزوتوپ

 عدد جرمی ايزوتوپ که آنرا تا 4 رقم بعد از اعشار می توان بدست آورد که با هيچ تکنيک

    ديگری بجز MS قابل حصول نيست.

 

The mass spectrometer

اصول MS بسيار ساده و قابل فهم است اما اين سادگی، در ابزار الکترونيکی و مکانيکی دستگاه مشاهده نمی شود. شکل 1-18 کتاب اسکوگ اجزاء دستگاه MS را نشان می دهد.

اجزاء دستگاه MS

1-Inlet: مقدار ميکرومول يا کمتر از گونه را به دستگاه معرفی می کند.

2-ion source: در اثر بمباران با الکترونها، يونها و مولکولهای خنثی و حتی فوتونها مولکولهای گازی به شکل مولکولهای گازی تبديل می شوند.

3-mass analyzer: نقش آن مثل grating است و يونها را بر مبنای m/z  آنها جدا می کند.

4-detector: اشعه يونی را به انرژی الکتريکی تبديل می کند.

تمام اين قسمتها در خلاء torr ^8-10 -^4-10 قرار می گيرند.

 

Batch inlet	Sample inlet system
Direct probe inlet
chromatograph

 

نمونه هايی که می توان به دستگاه معرفی کرد:

1-گازها

2-مايعات و جامداتی که نقطه جوش آنها تا حدود C°500 و کمتر است.

 

Direct probe inlet

اين سيستم برای نمونه های مايع و جامدی که فراريت پايينی دارند يا براثر حرارت تجزيه می شوند بکار می رود. در اين روش از يک پروب استفاده می شود که می تواند يک لوله ظريف و کاپيلاری از جنس Al يا يک شيشه يا سيمی از جنس رنيم و تنگستن و ... باشد. ابتدا نمونه را روی پروب قرار می دهيم. پروب روی وسيله ای سوار شده است که می تواند نمونه را به نزديکترين فاصله محفظه يونيزاسيون منتقل کند. پروب قابليت گرم شدن و يا سرد شدن سريع را دارد. براثر افزايش دما نمونه به شکل گازی در می آيد و به دليل اختلاف خلاء بين محفظه يونش و تزريق تبخير می شوند. با توجه به حرارت سريه و فاصله کم ، احتمال تجزيه حرارتی نمونه ها پايين می آند و می توان نمونه های حساس به حرارت و فراريت پايين مثل ترکيبات آلی فلزی، استروئيدها و حتی پليمرهای با وزن مولکولی کم را به دستگاه تزريق کرد. از اين روش برای تزريق نمکهای فلزی به سيستم هم استفاده می شود. می توان ترکيبات ليتيم، روی، استرانسيم و اورانيوم را به اين شيوه به دستگاه تزريق نمود.

از آنجاييکه در مرحله انتقال پروب به بيرون (برای تعويض نمونه) مقداری از خلاء شکسته می شود و برای برگشت به خلاء اوليه زمان زيادی لازم است. لذا برای رفع اين مشکل گردونه ای ساخته شده که امکان سوار شدن تعداد زيادی پروب روی آن فراهم می شود. در اين سيستم، نمونه گذاری برای يک بار انجام می شود و پروبها يکی پس از ديگری نزديک محفظه قرار گرفته و براثر افزايش دما به منبع يون منتقل می شوند (شکل 24-12).

 

Detectors

در طيف سنجهای جرمی از دو دتکتور بيشتر استفاده می شود:

1-electron multiplier

اين سيستم کاملا شبيه فوتومالتی پلاير است، بدينصورت که يونها با کاتد برخورد می کنند و الکترونهايی از کاتد کنده و به سمت داينودها گسيل می شوند و در نهايت سيلی از الکترونها از خروجی آشکارساز بيرون می آيد (شکل a2-11).

در سيستمی که 20 داينود دارد جريان به اندازه 107 مرتبه تشديد می شود. نمونه ديگری از اين سيستم، الکترون مالتی پلاير پيوسته است که شبيه يک شيپور با دو بازوی شيشه ای است که در سطح شيشه سرب قرار دارد (شکل b2-11). بين اين دو بازو اختلاف پتانسيل AC kV 2-8/1 اعمال می شود که منجر به تشديد جريان يونی می شود که به بازوها برخورد می کنند. معمولا gain يا بزرگنمايی آن 105 است که به 108 نيز قابل افزايش است. اين آشکارساز بسيار قوی، قابل اعتماد و با بزرگنمايی بالاست. اشکال آن مربوط به قيمت بالای آن است. همچنين جريان سياه بزرگی دارد.

2-faraday cup

نقش ترمز دارد و سرعت کاتيونها را می گيرد تا آرام وارد آشکارساز شوند. آشکارساز دارای يک الکترود است که معمولا بصورت اريب قرار دارد تا يونهای برخورد کننده برنگردند. يونهای برخورکننده جذب آن می شوند و پس از برخورد سطح آنرا مثبت می کنند. باعث می شود خروجی دتکتور که به زمين متصل است در مقاومت افت پتانسيل ايجاد می شود و بعد به آمپلی فاير وصل است تا افت پتانسيل را جبران و ثبت نمايد.

مزيت: پاسخ اين آشکارساز مستقل از جرم و انرژی سينتيکی يونهاست، همچنين ساده و ارزان است.

معايب: حساسيت پايين دارد و بايد سيگنال خروجی آن با کمک يک آمپلی فاير تشديد شود.

 

Mass Analyzers

اين قسمت از دستگاه يونها را بر مبنای m/z جداسازی و sort می کند. ويژگيها: اولا بتواند بين جرمهای کوچک اختلاف قائل شود. و ثانيا به تعداد کافی از يونها اجازه عبور دهد تا اندازه گيری جريان يونی بسادگی صورت پذيرد. توانايی دستگاه MS برای جرمهای کوچک Rs است:

 

 (1)                           

 

رزولوشن دستگاههای جديد در گستره 500000-500 و حتی 10⁶ است.

مثال: برای جداسازی يونهای با جرم 0313/28 و 0187/28 قدرت جداسازی دستگاه را محاسبه کنيد.

 

    0.0126 M=28.05            Δm=

 

magnetic sector analyzer

اولين و قديمی ترين آناليزور است که آناليزور با کمان مغناطيسی نيز نام دارد. در اين آناليزور از يک ميدان ميدان مغناطيسی دائمی يا الکتريکی برای حرکت يونها در يک مسير دايره ای شکل با اندازه کمان 60، 90 و 180 درجه استفاده می شود ( شکل 12-20) در اين سيستم ابتدا يونها در منبع يونيزاسيون ايجاد و سپس شتاب داده شده و آناليزور که تحت خلاء torr ^7-10 است  وارد می شوند. يونهای متفاوت براثر جارو کردن پتانسيل شتاب دهنده يا قدرت ميدان مغناطيسی در شکاف خروجی خارج و وارد آشکارساز می شوند. انرژی سينتيکی يونهايی که در ميدان حرکت می کنند از رابطه زير قابل محاسبه است.

 

انرژی سينتيکی فقط به پتانسيل شتاب دهنده و بار يون وابسته، و از جرم يونها مستقل است. تمام يونهايی که تحت پتانسيل يکسانی شتاب داده می شوند انرژی سينتيکی متفاوتی دارند. وقتی يون شتاب يافته وارد ميدان مغناطيسی می شود دو نيروی 1-ميدان مغناطيسی و 2-گريز از مرکز به آن وارد می شود. هنگاميکه اين دو نيرو برابر باشند يونها در مسير دايره ای حرکت می کنند.

 

(۳)      نيروی ميدان مغناطيسی            (4)             نيروی گريز از مرکز                                                                          

 

برای جداسازی m/z اين پارامترها در دست است. برای تغيير m/z می توان r و B را تغيير داد

 

Double focusing spectrometer

اين آناليزور و آناليزور قبلی نمونه ای از سيستم تک تمرکزی هستند. يعنی يونهای خارج شونده به شکل هم جهت در مي آيند. هرچند اين ميدان می تواند يونها را در يک نقطه متمرکز کند ولی قادر نيست در مورد توزيع انرژی سينتيکی کاری انجام دهد. همين عامل موجب پهن شدن باندها و محدود شدن قدرت جداسازی می شود و R_s به کمتر از 2000 کاهش می يابد.

در اينجا از ميدان الکتريکی و مغناطيسی که به دنبال هم قرار گرفته اند استفاده می شود (شکل 13-20). ابتدا يونها از ميدان الکتريکی عبور می کنند. درواقع ميدان الکتريکی نمونه ای از يک ميدان DC است. اين ميدان توزيع انرژی سينتيکی يونها را بشدت محدود می کند. يونهايی که انرژی سينتيکی آنها از يک حد کمی بيشتر است براثر برخورد به صفحه بالايی و پايينی از سيستم حذف می شوند و يونهايی که انرژی سينتيکی برابر دارند از انتهای ميدان خارج و وارد ميدان مغناطيسی می شوند. بکمک سيستم direct focusing می توانند رزولوشن را تا حد 105 نيز افزايش دهند. نقض ميدان الکتريکی: يونهايی با انرژی سينتيکی متفاوت را حذف می کند. و يونهای با انرژی سينتيکی برابر از آن خارج و وارد آشکارساز می شوند.

 سيستم کوادروپل

در حال حاضر معمولترين آناليزور است (شکل 4-11). در مقايسه با ساير آناليزورها ارزانتر، راحتتر و زمان اسکن آن کوتاهتر است. با اين سيستم کل طيفها در کمتر از ms100 ثبت می شود. اين آناليزور از 4 الکترود ميله ای تشکيل شده که روبروی يکديگر قرار گرفته اند. دو الکترود به قطب مثبت يک منبع DC و دو الکترود ديگر به قطب منفی آن وصل شده اند. همچنين يک پتانسيل AC با فرکانس امواج راديويی هم به اين الکترودها اعمال می شود. برای اينکه طيف جرمی را مشاهده کنيم ابتدا يونها شتاب داده شده و وارد بخش مرکزی ميله ها شده و پتانسيل AC و DC شروع به افزايش می کنند بطوريکه نسبت پتانسيل آنها همواره مقداری ثابت است.

در هر لحظه تمام يونها بجز آنهاييکه m/z مشخص دارند به ميله ها برخورد کرده و به مولکولهای خنثی تبديل می شوند و يونهای با m/z مشخص به دتکتور می رسند. با اين سيستم امکان جداسازی يونهايی که اختلاف m/z واحد دارند امکانپذير است. جداسازی شبيه جداسازی پرتو بوسيله فيلتر است. لذا از لفظ فيلتر جرمی نيز استفاده می شود.

مسير يونها در سيستم کوادروپل: برای اينکه ظرفيت فيلتری کوادروپل را درک کنيم لازم است اثر پتانسيلهای AC و DC بر مسير حرکت يونها مشخص شود. فرض می کنيم يونهايی که جداسازی می کنيم مثبت هستند. اگر فرض کنيم ميله های مثبت در صفحه XZ قرار دارند. اول فرض می کنيم فقط پتانسيل AC را به ميله ها اعمال می کنيم. در حالتی که ميله ها در نيمه مثبت پتانسيل هستند يونها به سمت مرکز ميله ها نزديک می شوند و وقتی نيمه منفی پتانسيل AC اعمال می شود به ميله ها نزديک می شوند. اينکه آيا به ميله ها برخورد کنند يا نکنند به مقدار پتانسيل يا دامنه پتانسيل و فرکانس و m/z يونها بستگی دارد. حال فرض می کنيم پتانسيل DC را نيز اعمال کنيم. اينکه آيا يونها فقط تحت تاثير پتانسيل DC يا AC قرار گيرند به سه پارامتر فوق بستگی دارد. طبق قانون نيوتن اندازه حرکت يونها با  ارتباط دارد. هرقدر جرم يون بيشتر باشد اندازه حرکت آن بيشتر است. در نتيجه تغيير مسير يون بيشتر است. مسير فقط تحت تاثير پتانسيل DC قرار می تواند از داخل ميله ها عبور کند پس اگر عبور يونهای مختلف را مبنا قرار دهيم به اين دو الکترود high pass mass filter گفته می شود. يهنی جرمهايی را عبور می دهد که از يک حد بزرگترند. اگر به ميله های منفی برگرديم اگر فقط ميدان DC را اعمال کنيم بديهی است همه يونها جذب ميله ها شده و حذف می شوند. ولی وقتی پتانسيل AC به ميله ها اعمال شود يونهای سنگين جذب ميله ها شده ولی يونهای سبک که تحت تاثير AC قرار می گيرند از داخل ميله ها عبور می کنند به اينها low pass mass filter  گفته می شود اگر 4 الکترود را کنار هم درنظر بگيريم می تواند محدوده باريکی از جرمها برا عبور دهد با تغيير قدرت ميدان AC و DC در حاليکه نسبت ثابت دارند می توان ... m/z راتغيير دهيم و درنتيجه m/z های مختلف را از سيستم کوادروپل خارج کنيم. (شکلهای 5-11 و 6-11). حال می خواهيم نحوه اسکن کردن برای جداسازی يونها را ببينيم.

 

ادامه نوشته

 

 

مباحث نوين در شيمی تجزيه

 

1- کروماتوگرافی گازی

 Gas Chromatography: a practical approach

GC: instrumentation, operation and experimental consideration

 قسمتهای مختلف دستگاه کروماتوگراف گازی:

 

Carrier gas

flow control

Sample introduction

Oven

Column

detector

interface

computer

recorder

 

اگر بخواهيم سيستم خوبی داشته باشيم نه تنها طراحی دستگاه بلکه کنترل شرايط هر قسمت از دستگاه نيز در عملکرد آن می­تواند موثر باشد.

اولين قسمت دستگاه، سيستم آون است. اساس جداسازی، توزيع گونه بين فاز ساکن و فاز متحرک است و علاوه بر خصوصيات فاز ساکن به دما نيز بستگی دارد. بايد بتوان با دقت بسيار زياد دمای آون را کنترل نمود. اعمال تکرارپذير برنامه دمايی نيز نقش موثری در جداسازی دارد.

     

آون

توزيع

دما

کنترل

اعما ل تکرازپذير برنامه دمايی

برای کار در دمای پايين می­توان از نيتروژن مايع و يا کربن دی­اکسيد جامد برای خنک کردن سيستم استفاده کرد.

قسمت بعدی gas supplier ها هستند. درجه خلوص گاز حامل بسيار مهم است و بايد بالاتر از 999/99% باشد. حضور مقادير جزئی از اکسيژن و آب می­تواند موجب تخريب فاز ساکن شود. لذا توصيه می­شود در مسير گاز يک تله اکسيژن-سيليکاژل قرار گيرد. بعضی از گازها در سيلندرهای تحت فشار عرضه می­شوند و بعضی ديگر توسط دستگاه ژنراتور توليد می­شوند (مانند هيدروژن و هوا).

 

 

He	Gas supplies
H2
N2
Ar+Methane
Air

  Injection Port

قسمت بعدی که مورد بحث روز است بخش تزريق نمونه است.

 

نوع نمونه	Sample Introduction
ماتريس نمونه
غلظت نمونه
نوع ستون

  

1) Packed column injectors

                                                                                                                ميزان نمونه قابل تزريق به اين محفظه ها  0.1-10µl  است.

 

a) flash vaporization injection

 

b) direct injection

column with 0.53mm diameter also can be used

 

 liners  که بخشی از محفظه تزريق را تشکيل می دهند باعث می­شوند نمونه با بدنه محفظه تزريق تماس پيدا نکند. در حالتی که liners وجود نداشته باشد و نمونه مستقيما وارد ستون شود اين روش، direct نام دارد.

 

2) Split/splitless injection

شکل 4 و 5 شمای اين قسمتها را نشان می­دهند.

       

a)split injection

در اين روش شير ميکرو در طی تزريق (و معمولا در طی آناليز) باز است و درنتيجه فلوريت بالاست و باعث عبور سريع نمونه  از liner محفظه تزريق و عرض ستون می­شود و بنابراين پهنای نوار نمونه ورودی به ستون را کاهش می دهد، بنابراين رزولوشن افزايش می­يابد. split injectionبرای نمونه های گازی (gas syringe) و يا نمونه های جامد (pelletizer) می تواند بکار رود اما معمولا برای نمونه های مايع که حجم تزريقی آنها بطور نرمال 1/0 تا 0/1 است بکار می رود. نسبت فلوريت خروجی به فلوريت ورودی به ستون، split ratio ناميده می شود و نوعا در گستره 1: 300-200 است-نسبتهای اسپليت پايين تر موجب پهن شدن پيکها می شوند و نسبتهای اسپليت بالاتر کنترل گاز حامل را مشکل می کنند و زمان در دسترس برای تبخير نمونه را کاهش می دهند، بنابراين بر اجرای فرايند اسپليتينگ اثر می گذارد. تنها مشکل موجود اين است که مقدار نمونه­ای که وارد ستون می شود کم است و حساسيت کاهش می­يابد. نمونه های رقيق و تريس را نمی­توان با اين سيستم آناليز کرد. (وقتی نمونه ای تزريق نمی شود توصيه می شود شير اسپليت بسته باشد)

  

b)splitless injection

اين روش برای تعيين سطوح تريس در نمونه های مايع رقيق مناسب است. اين روش را نمی توان برای تزريق نمونه های گازی (no focusing) يا نمونه های جامد (مقدار بسيار زياد نمونه ) بکار برد. باند مربوط به حلال هميشه پهن است. در طی تزريق، شير خروجی بسته می ماند تا بر انتقال تمام نمونه به ستون کاپيلاری اثر بگذارد. شير خروجی حدود 30 ثانيه پس از تزريق برای پرژ کردن حلال از liner باز می شود که در غيراينصورت موجب تيلينگ پيک حلال می شود که آنهم پيک اجزاء اولی که شسته می شوند را غير واضح می کند. پهنای باند نمونه ای که وارد ستون می شود به نوع حلال ، مقدار تزريقی، فشار گاز حامل و دمای محفظه تزريق بستگی دارد. اين پهنای نوار برای کروماتوگرافی کاپيلاری بسيار بزرگ است و بنابراين فرمی از فوکوسينگهای ثانويه مانندcold trapping، solvent effect وretention gap را بايد بکار برد:

 cold trapping

در اين روش دمای آون حداقل ºC100 کمتر از نقطه جوش اجزاء موردنظر است. وقتی اين اجزاء وارد ستون می شوند بصورت يک نوار باريک روی ديواره های ستون متراکم می شوند و تا آغاز برنامه دمايی در آنجا می مانند.

 solvent effect

در اين شيوه دمای ستون ºC 20 کمتر از نقطه جوش حلال انتخاب می شود. وقتی نمونه در محفظه تزريق حرارت داده می شود، اگر حلال فرارتر از اجزاء موردنظر باشد تبخيرشده و وارد ستون می شود. مقداری از حلال متراکم خواهد شد و روی ديواره های ستون جمع می شود. با ورود گونه ها به داخل ستون در آنجا trap می شوند. پس از مدت زمان مشخصی برنامه دمايی به اجرا در می آيد ابتدا حلال بخار شده و گونه ها را بصورت نوار باريکی بجای می گذارد. اين روش را نمی توان در مورد اجزاء فرارتر از حلال بکار برد. مسئله ای که در solvent effectوجود دارد اين است که اگر مقدار زيادی از حلال متراکم شود بويژه اگر حلال پلاريته بسيار متفاوتی با فاز ساکن ستون داشته باشد سطح آنرا خيس نخواهد کرد و می تواند بوسيله گاز حامل در طول ستون بطور فيزيکی رانده شود. اين solvent flooding effect ممکن است نمونه را در طول ستون تفکيک نموده و پيکهای چندتايی يا کج شده برای بعضی از اجزاء بدهد.

retention gap

در حالتی  که مقدار زياد حلال وارد ستون می شود ممکن است ستون را آلوده کند. اين تکنيک بر  solvent flooding effect  غلبه می کند و درجه بيشتری از فوکوسينگ را فراهم می آورد. لذا از يک لوله کاپيلاری غيرفعال و بطور نرمال بدون پوشش بنام retention gap استفاده می شود که قطر آن mm53/0 و 2 متر طول دارد و گروههای سيليکای آن غيراکتيو شده اند و بين ستون و محفظه تزريق قرار می گيرد. در اينجا برای کاهش پهنای باند نمونه ها و جداسازی باند نمونه از حلال از اثر حلال استفاده می شود. در اينجا نيز شرايط مانند solvent effect تنظيم می شود.

اجازه داده می شود حلال متراکم شده و اجزاء نگاه داشته شده در طول اين لوله پخش شوند-مهم است که حلال قبل از رسيدن به ورودی ستون تبخير شود يا focusing effect از دست خواهد رفت. سپس آون تحت برنامه دمايی قرار گرفته و حلال، تبخير شده و اجزاء موردنظر را در طول retention gap بجای خواهد گذاشت. با افزايش دما، اجزاء بنوبت تبخير شده با گاز حامل به سمت ورودی ستون حرکت می کنند. وقتی يک جزء وارد ستون می شود در فاز ساکن تقسيم شده و حرکت آن کند شده و موجب focusing effect می شود.

همانطوريکه از تکنيکهای focusing effect فوق مشاهده می شود انتخاب حلال و دمای اوليه آون در تزريق splitless بسيار بحرانی است. حجمهای تزريق تمايل دارند بزرگتر از split injection باشند (1 تا 10 ميکروليتر، اما حجمهای تزريق بزرگتر با extended retention gaps امکانپذير است). اما بايد مراقب بود که سرعت تزريق مانع flashback نمونه به داخل خطوط لوله گاز حامل يا سپتوم شود (5/0 ميکروليتر بر ثانيه سرعت مناسبی است). اکثر تزريقگرها برای تميز کردن سپتوم و جلوگيری از ورود مواد رسوب کرده (يا فرار از درون خود سپتوم) به ستون که ممکن است موجب ghost peak در کروماتوگرافی بعدی شود از يک septum purge gas استفاده می کنند.

3) temperature-programmed vaporization injection (PTV)

اين نوع محفظه تزريق شبيه split/splitless است با اين تفاوت که liner قابليت گرم و سردشدن سريع را با ramp بزرگ دارد. در اين روش ابتدا نمونه تحت دمای پايين تزريق می شود بنابراين مشکلات ناشی از تجزيه حرارتی  و discrimination اجزاء نمونه از بين می رود. سپس با افزايش تدريجی دما ابتدا حلال و سپس گونه ها بترتيب وارد ستون می شوند. مزيت عمده اين نوع محفظه تزريق، امکان تزريق تکرارپذير نمونه به ستون است.

يک روش مشابه PTV را برای cold on-column injection می توان بکار برد که در آن يک retention gap يا ستون به قطر mm53/0 وارد liner سرد با هدايت کننده سوزن می شود و تزريق مستقيم را با يک سرنگ معمولی به درون ستون يا retention gap انجام می شود. پس از  تزريق liner گرم می شود تا تمام نمونه به درون ستون اصلی حرکت کند.

 

4) Cold on-column injection

در اين روش حجم مشخصی از نمونه به ابتدای ستون کاپيلاری که سرد است تزريق می شود. اين روش بهترين شيوه تزريق است و بالاترين کارايی را دارد زيرا تزريق در دمای معمولی انجام می شود و تکرارپذيری آن زياد است. ازطرف ديگر با مشکلات حلال و گونه که باعث پهن شدن پيکها می شود مواجه نيستيم. اما متاسفانه از نظر استفاده مشکلترين تکنيک است.  در اين شيوه از سرنگهايی استفاده می شود که قطر سوزن آنها کم است (22/0 ميلي­متر). بعنوان يک آلترناتيو برای تزريق splitless (کلاسيک يا PTV) است. محفظه تزريق اساسا يک سيستم هدايت سوزن خنک شده است تا الحاق مستقيم سوزن بسيار باريک سرنگ را به درون يک ستون کاپيلاری با منفذ باريک (کمتر از 2/0 ميلي­متر) را ممکن سازد. يک فاکتور بحرانی طراحی سيستم sealing است که نمی توان از يک سپتوم معمولی استفاده نمود زيرا سوزن به اندازه کافی قوی نيست تا داخل آن نفوذ کند. طرحهای مختلفی شامل compression seals، شيرهای مکانيکی و pneumatic rings توسط سازنده های گوناگون ارائه شده است. پس از تزريق برنامه دمايی اجرا می شود. در اينجا هيچ تبخير حد واسطی وجود ندارد و اين برتری نسبت به ساير تکنيکهاست. اين مهم است که تبخير در سوزن سرنگ اتفاق نمی افتد زيرا بر کارايی اثر می گذارد. بنابراين محفظه تزريق در طی تزريق با يک ژاکت که از درون آن هوا يا يک محيط زير دمای محيط جاری است خنک می شود. مانند روش splitless فوکوسينگ اجزاء لازم است. پس آن تکنيکها در اينجا نيز بکار می روند. دمای آون نبايد بالاتر از نقطه جوش حلال باشد در غيراينصورت تبخير انفجاری رخ خواهد داد و موجب آلودگی محتمل نيوماتيکی، اتلاف نمونه و شکل ضعيف پيکها می شود. استفاده از مخصوصا retention gap توصيه می شود زيرا بعنوان ستون محافظ نيز عمل می کند و از ورود مواد غيرفرار به ستون اصلی جلوگيری می کند.

 معايب:

1-چون قطر سوزن بسيار باريک است حتی نرم­ترين سپتوم هم باعث کج شدن سوزن می شود برای رفع اين مشکل از سيستمهای تزريقی استفاده می شود که بدون سپتوم هستند و بطور خودکار باز و بسته می شوند.

2-آلوده شدن ستون که برای رفع آن از retention gap استفاده می شود.

 

5) gas sampling valve (gsv)

در اين نوع محفظه تزريق که برای تزريق نمونه های گازی بکار می رود از يک شير تزريق استفاده می شود. اين شير حجم loop معينی دارد (1/0، 2/0، 5/0، 0/1، 0/2 و 5/0 ميلي­ليتر). ابتدا نمونه گازی را تزريق می کنيم با چرخش شير، loop در مسير گاز حامل قرار می گيرد و می تواند نمونه را تزريق کند. در صورتيکه ستون کاپيلاری بکار رود بايد از روش split (از يک اسپيليتر بين شير و ستون) يا از يک ميکرو gsv با طراحی خاص استفاده کنيم چون فشار می­تواند به ستون صدمه بزند (حداکثر فشار 10 اتمسفر را تحمل می کند). شيرهای HPLC قابليت تحمل فشار بيشتری را دارد. فشار درون لوپ می تواند با فشار اتمسفری يا فشار بالاتر در تعادل باشد. شير را برای جلوگيری از ميعان نمونه های کم فرار می توان گرم نمود. علاوه بر تزريق نمونه، gsvها با پورتهای 4، 6، 8 يا 10 در دسترسند می توانند به طرق مختلف برای اجرای تکنيکهای سوئيچينگ ستون، مانند کروماتوگرافی چند بعدی و backflushing بکار روند.

 

6) liquid sampling valve

از نظر عملکرد شبيه gsv است اما در آن از يک internal sampling 'loop' استفاده می شود. فقط برای تزريق گازهای مايع شده مانند گاز نفت مايع استفاده می شود. در اين نوع محفظه تزريق بعد ازloop محفظه ای داريم که بشدت داغ شده و نمونه با گاز حامل وارد آن می شود. اين آون مخصوص  retention gap است. برای ستونهای کاپيلاری، يک اسپيلتر بين

7) pyrolyzer

برای مطالعه رفتار حرارتی پليمرها و ترکيبات مختلف با استفاده از GC بکار می رود. مقداری از نمونه در يک لوله از جنس شيشه يا کوارتز قرار داده می شود که سپس در يک هيتر (curie point or ohmic heating) قرار داده می شود. اين هيتر می تواند بشکل برنامه ريزی شده حرارت داده شود و دمای آن نوعا تا 1000 درجه بالا می رود. اين دما موجب شکستن مواد به قطعات کوچکتری می شود که گاز حاملی يا بی­اثری که از داخل پيرولايزر عبور می کند آنها را وارد لوپ تزريق می کند و با اسپيليت وارد ستون کاپيلاری می شود. ترکيبات حاصل از پيروليز وارد ستون می شوند و پيروگرام رسم می شود.

 8) Headspace analyzer

نمونه های مايع يا جامد در يک ويال ترموستات شده و سيلد شده با يک گاز بی اثر در فشار کنترل شده که فضای بالای نمونه را اشغال می کند قرار می گيرند. اين سيستم برای مدت زمان مشخصی که در طی آن اجزاء فرار ماتريس خارج شده و با فضای بالا در تعادل قرار می گيرند باقی می ماند. سپس حجم ثابتی از فضای بالای آن نمونه برداری شده و از طريق يک splitter يا cryogenic trap به ستونهای کاپيلاری منتقل می شود.

برای آناليز گونه های فرار موجود در آب استفاده می شود. حجم مشخصی از نمونه آب را داخل ظرفی قرار داده و سر ظرف را کاملا سيل می کنيم. مقداری گاز بی اثر مثل هليوم را به سر آن تزريق می کنيم و محتويات را داخل يک حمام ترموستات­دار قرار می دهيم تا دمای آن به مقدار مشخصی برسد. بعد از اينکه گونه ها بين محلول و headspace به تعادل رسيدند حجم مشخصی از گاز فضای بالای نمونه مستقيما توسط سرنگ گازی يا از طريق شير تزريق به دستگاه تزريق می شود. در سيستمهای جديد عمل تزريق می تواند بطور اتوماتيک انجام شود.

مزيت: می توان در بافتهای پيچيده ای مانند خون ترکيبی مانند الکل را اندازه گيری کرد يا در فاضلاب ترکيبات پيچيده ای مانند پلی سايکليکها را اندازه گيری کنيم.

 9) Thermal Desorption

مثل روش فوق است با اين تفاوت که برای استخراج و آناليز ترکيبات فرار در نمونه های جامد بکار می رود. نمونه جامد در داخل ظرفی قرار می گيرد و حرارت با سيستم ترموستات دار کنترل می شود. گاز حامل از يک طرف وارد نمونه و از طرف ديگر خارج می شود نمونه های فرّار وارد ابتدای ستونی که کاملا سرد شده می شوند و پس از اينکه استخراج کاملا انجام شد با استفاده از برنامه دمايی جداسازی و اندازه گيری انجام می شود.

 10) Purge and Trap

برای استخراج، تغليظ و تزريق گونه های فرار به دستگاه GC استفاده می شود. روش کار: حجم مشخصی از نمونه مثلا ml100 را به داخل ظرفی قرار می دهند. سپس بکمک گازی مانند نيتروژن حبابهاي ريزی را در داخل نمونه ايجاد می کنند که اين حبابها به سطح می آيند و ترکيبات فرار توسط گاز به داخل يک تله هيدروفوب منتفل می شود. ترکيبات هيدروفوب در سطح تله جذب می شوند و نمونه آب از تله عبور می کند پس از مدت مشخصی که استخراج به اتمام رسيد دمای تله بسرعت افزايش می يابد، گونه های جذب شده واجذب و از طريق gsv يا بطورمستقيم به ابتدای ستون منتقل و جداسازی در آن رخ می دهد به جای اين تله ممکن است از تله نيتروژن مايع برای جمع آوری گونه های استخراجی استفاده شود.

      

11) Autosampler

در اينجا نمونه ها داخل ظروف خاصی قرار گرفته و روی چرخانک قرار می گيرند و با برنامه ريزی قبلی بصورت اتوماتيک در فواصل زمانی مشخصی گونه ها از داخل ظرف کشيده شده و به دستگاه تزريق می شود.

مزيت: عدم نياز به اپراتور و امکان کار 24 ساعته است. خطای تزريق کاملا از بين می رود زيرا شرايط کاملا يکسان است. اين سيستم بيشتر در مراکز کلينيکی و جاهايی که مقدار نمونه­ها زياد است مورد استفاده قرار می گيرد.

Gas Chromatographic Detectors

Classes of Detectors	انتخابی عمل کردن	عمومی (به هر چيزی بجز گاز حامل جواب می­دهد)
		انتخابی (می­تواند به دسته ترکيبات خاصی جواب دهد)
		ويژه (فقط به يک ترکيب خاص جواب می­دهد)
	شيوه پاسخ دهی	Concentration dependent اين نوع آشکارساز نسبت به غلظت گونه موجود در فاز متحرک جواب می­دهد (مانند TCD). ويژگيها: 1-حجم سل کاملا مشخص است. 2-پاسخها با استفاده از makeup کم می­شود زيرا آناليت رقيق می شود. مخصوصا برای ستون کاپيلاری که برای جلوگيری از پهن شدن پيکها از اين گاز استفاده می شود. 3-غيرتخريبی هستندو می توانند با ساير آشکارسازها سری شوند.
		mass flow (g/t) آشکارسازهای تخريبی مانند FID سيگنال با سرعت ورود نمونه به دتکتور بستگی دارد.

  1) FID

اولين و مهمترين آشکارساز، Flame Ionization Detector (FID) است. استفاده از اين آشکارساز بسيارساده است. خروجی ستون با گاز هيدروژن مخلوط می شود و مخلوط از طريق يک جت وارد محفظه­ای می شود که در آن از جا هوا وارد می شود. هوا و هيدروژن می سوزند و شعله ای ايجاد می شود.

براثر سوختن اتمهای کربن 001/0% آنها يونيزه می­شوند و جريانی در مدار بيرونی مشاهده می شود اين  جريانها در حد ^9-10 آمپر است که تقويت می­شوند. حد تشخيص ^14-10 گرم بر ثانيه است يا m ^9-10 از گونه –CH₂ را که با سرعت جريان ml/min60 آشکارسازی می کند.

مزيت اين آشکارساز محدوده خطی زياد (4 درجه نمايی)  است  (از کمتر از ppm تا مولار).

 2) TCD

در واقع همان پل ويتسون است که دو فيلامان دارد. يکی بعنوان رفرنس و ديگری مربوط به نمونه است. به محض ورود نمونه، فيلامان نمونه گرم می شود و در نتيجه جريانی را مشاهده می کنيم که به تغيير مقاومت  ΔR بستگی دارد و ΔR هم به نمونه بستگی دارد. فيلامانها هردو گرم هستند لذا نسبت به عبور گاز حساس می شوند. هميشه دمای فيلامان بايد از دمای بدنه بيشتر باشد. اگر دمای گاز حامل و فيلامانها يکسان باشد سيگنالی مشاهده نمی شود لذا بايد اختلاف قابل ملاحظه ای داشته باشند. ماکزيمم دمای TCD ºC190 می باشد. گاز حامل مورد استفاده هميشه بايد هدايت گرمايی زيادی داشته باشد.

 

Conductivity	Carrier gas
41.6*10^-5	H2
34.8*10^-5	He
5.8*10^-5	N2
1-4*10^-5	Organic compounds

 

محدوده غلظتی: mol/ml ^7-10 – ^6-10 در حد mV 1

مزايا:

1-               عمومی بودن آشکارساز

2-               سادگی

3-               گستره خطی نسبتا وسيع

 

معايب:

1-حساسيت کم

2-عدم قابليت برای اتصال به سيستمهای کاپيلاری (البته در سالهای اخير با کاهش حجم فيلامانها آنرا برای کاپيلاری توسعه داده اند).

 

3) ECD

در اين آشکار ساز سلی وجود دارد که معمولا حاوی يک منبع راديواکتيو مانند Ti³H، Sc³H و ⁶³Ni برای توليد اشعه β است.

 

4) Nitrogen-Phosphorus Detecor (NPD or TID)

اين آشکارساز در مقايسه با FID نسبت به ترکيبات فسفره (500 برابر) و نيتروژن دار (50 برابر) حساستر است و بيشتر برای آناليز سموم فسفره و ترکيبات نيتروژن دار مناسب است. از نظر ساختار شبيه FID است با اين تفاوت که بين جت و کالکتور بستری از سيليکات است که يکی از فلزات قليايی، معمولا روبيديم، در آن dope شده است. اين بستر به روش الکتريکی حرارت داده می شود. ابتدا جريان کوچکی از هيدروژن (ml/min 2) با گاز حامل مخلوط شده و وارد محفظه­ای می شود که اکسيژن از مسير ديگری وارد آن شده است. در اثر تماس با بستر گرم شده شعله ای تشکيل می شود که ساختار پلاسما دارد. کالکتور نسبت به بستر سيليکا و جت دارای پتانسيل مثبت mV2 است. وقتی تغيير گاز حامل داريم جريان کوچکی مشاهده می شود. به محض ورود ترکيبات نيتروژن­دار و فسفردار جريان بسيار بزرگی ظاهر می شود.

در مورد مکانيسم عمل اين دتکتور جنجالها و تئوريهای زيادی ارائه شده است ولی تئوری Kolb تا حدود زيادی پذيرفته شده است. براساس اين تئوری در دمای عمل بستر از نظر الکتريکی رساناست و بعضی از اتمهای Rb قادر به جذب يک الکترون و تبديل به فرم اتمی هستند. اين اتمها نسبتا فرارند و به درون پلاسما (جايی که با محصولات احتراق واکنش می دهند) منتشر می شوند و مجددا يونيزه می شوند و روی بستر بطور منفی قطبی شده جمع آوری می شوند. اين چرخه سيگنال زمينه را بوجود می آورد. به محض ورود ترکيبات حاوی پيوندهای C-N و P=O- که قادرند الکترون بگيرند و به آنيونهای cyan يا اکسيدفسفر تبديل شوند اين چرخه يا تعادل بهم می خورد و موجب می شود اتمهای بيشتری از Rb وارد شعله شوند و با توجه به افزايش تعداد يونها جريان و بنابراين سيگنال افزايش می يابد. اين آشکارساز فقط نسبت به ترکيباتی که نيتروژن آنها با کربن پيوند کووالانسی دارد پاسخ می دهند اما در ترکيبات فاقد اين پيوند (مانند گاز نيتروژن، کارباماتها، اوره و باربيتوراتها و ...)سيگنال ضعيفی حاصل می شود لذا می توان از گاز نيتروژن بعنوان گاز حامل نيز استفاده کرد.

تشکيل آنيونهای سيان را می توان با افزايش دمای واکنش با افزايش فلوی هيدروژن (گرم کردن الکتريکی بستر تحت اين شرايط غيرضروری است) کاهش داد که اين مود برای گزينش پذيری آشکارساز نسبت به ترکيبات فسفر دار مناسب است. تحت اين مود جت معمولا به زمين اتصال داده می شود.

 

5) Flame photometric detector

نسبت به ترکيبات حاوی گوگرد، فسفر، آرسنيک، جرمانيم، تلوريم، کروم و قلع حساس است. خروجی ستون با گاز هيدروژن مخلوط شده و در محفظه ای که اکسيژن از آن عبور می کند می سوزد. گونه ها با ورود به شعله می سوزند و برخی از آنها منجر به توليد حد واسطهای ِکمی لومينساس می شوند که در طول موج خاصی نشر می کند. آشکارساز در اينجا PMT است. با استفاده از يک فيلتر می توان نشر شعله را حذف و نشر گونه خاصی را بگيريم. با تعويض فيلتر می توان آشکارساز را به حالت خاص (ويژه) در آوريم. (در اينجا در واقع نشر مولکولی است ونه نشر اتمی).

 

5) Photo Ionization Detector (PID)

بدليل انتخابگری بالا نسبت بهFID در صنايع پتروشيمی و محيط زيست اهميت دارد. در اين سيستم خروجی ستون وارد سلی شده و تحت تابش نور UV قرار می گيرد. بعضی از مولکولها تحريک و يونيزه می شوند. با ايجاد اختلاف پتانسيل بين دو سر سل جريانی در مدار بيرونی مشاهده می شود. با انتخاب طول موج تابش که معمولا دارای انرژيهای 5/9، 0/10، 2/10، 9/10 وو 7/11 الکترون ولت است می توان به انتخابگری مورد نظر دست يابيم.

 

Operation and experimental consideration

 

۱   Where to start?

اولين مسئله داشتن دستورکار مشخص برای جداسازی است. برای بدست آوردن دستورکار می توان از روشهای مشخصی استفاده کنيم.

a)                within the laboratory

آيا در آزمايشگاه قبلا اين جداسازی انجام شده است؟

b)                from publications

نام ژورنالهای کروماتوگرافی مانند

J. Chromatographic Science

 

c) from regulatory authorities

 

d) from suppliers of column and instruments

مانند شرکت کروم پک

 

Installation and preparation  of the chromatograph

ابتدا بايد تمام ابزار مورد نياز در اختيار باشد تا بر مبنای دستورکار بتوانيم جداسازی را انجام دهيم. در صورت عدم وجود تمام ابزارها می توان براساس چارتهای موجود ابزار مناسب را انتخاب نمود. (دياگرام های زير)

آماده سازی محل تزريق

بسياری از مشکلات کروماتوگرافی گازی، از محل تزريق ناشی می شود لذا لازم است قبل از شروع کار اين قسمت چک شود. اين تست شامل اطمينان از پاک بودن، سالم بودن شيرها، هيترها، سيل ها و عدم وجود نشتی است.

برای تست نشتی معمولا ايزوپروپانول يا مخلوط 50:50 آن با آب را باسرنگ در محل اتصال تزريق می شود. اين ترکيب حتی کوچکترين حبابها را نشان می دهد.در سپتوم هنگامی که  سيستم خنک است را تحت فشار قرار می دهيم و از اين محلول استفاده می کنيم.

معمولا بهتر است مقداری پشم شيشه در داخل liner قرار داده شود تا از ورود تکه های سپتوم و هر ترکيب ديگری به داخل ستون  جلوگيری شود.

 

انواع سپتوم:

1-     سپتوم نرم: براحتی سوزن وارد آن می شود. اشکال: bleed زياد و در دماهای حداکثر تا ºC 200 مورد استفاده قرار می گيرد.

2-      سپتوم سفت: برای کار در دمای بالا استفاده می شود و bleed کم دارد. عيب: جنس آن سخت هست و خيلی سريع کيفيت خود را از دست می دهد.

برای تميز کردن liner از اسيدنيتريک دو مولار در دمای ºC 80 و در حمام الوتراسونيک استفاده می شود.

 

Column installation

نحوه نصب ستون، به انژکتور، دتکتور و نوع ستون بستگی دارد. نصب ستونهای packed 4/1 و 8/1 اينچ با استفاده از فرولهای مربوطه ساده است. در مورد ستونهای کاپيلاری اگر با قطر  mm53/0 باشد می­توان به دستگاههايی از نوع packed نصب نمود.

برای اتصال ستونهای کاپيلاری به محل اسپليت از فرولهای گرافيتی استفاده می شود و بعد از اينکه فرول از ابتدای ستون عبور داده شد بهتر است 2-1 سانتيمتر از ابتدای آن بريده شود. معمولا در حد 5/0 تا 3 سانتيمتر از ستون وارد محفظه تزريق می­شود. ولی در مورد دتکتور لازم است ستون از طرف دتکتور تا نزديکی جت وارد شود. اگر ميزان واردشدن ستون کمتر باشد بدليل افزايش حجم مرده، پيکها پهن و اگر بيشتر باشد پوشش انتهای ستون می­سوزد و براثر حرارت شعله انتهای ستون بسته می­شود. بعد از نصب ستون، سيستم از نظر نشتی تست شود.

 

امتحان نشت گاز:

راحت ترين راه حل: سر ستون در سمت دتکتور را باز کنيم بکمک تکه ای از سپتوم سرستون را بسته و فشار رگولاتور را روی lb/in²30 تنظيم کنيم. سپس خروجی گاز را بسته و بکمک صدا نشتيهای اساسی را پيدا کنيم. سپس بوسيله محلول50:50 آب وايزوپروپيل الکل قسمتهای مختلف را چک کنيم. در صورتيکه در زمان 15 دقيقه هيچ افتی در فشار ايجاد نشود سيستم نشتی ندارد.

Conditioning column

ستونهای تازه خريداری شده و ستونهايی که مدت زيادی از آنها استفاده شده است، ممکن است حاوی مقاديری حلال يا ناخالصيهای ديگر باشند. بنابراين قبل از شروع کار اين ناخالصيها بايد از ستون خارج شوند يا بعبارت ديگر ستون کانديشن شود.

روش علمی:

ابتدای ستون به محفظه تزريق وصل می­شود. گاز حامل را باز و از عدم وجود نشتی اطمينان حاصل می­کنيم. برای مدتی گاز را از آن عبور می­دهيم تا اکسيژن و ساير ناخالصيها از آن خارج شود. با برنامه دمايی، دمای ستون را از C°40 تا C°10 کمتر از دمای تحمل ستون و با سرعت C/min°5 افزايش می­دهيم و بمدت 30 دقيقه دمای ستون را حفظ می­کنيم. برای ستونهای تازه، مرحله 4 چندين بار تکرار می شود. سپس انتهای ستون را به آشکارساز وصل می­کنيم.

 

Carrier gas flowrate

اگر فلوريت بهينه شود بر کارايی اثر می گذارد و رزولوشن را افزايش می دهد. معمولا معيار تنظيم اوليه، قطر ستون است که اين فلوريت، تقريبی است. سپس با توجه به نوع ترکيب می توان فلوريت را بهينه نمود. در مورد ستونهای packed فلوريت بهينه برحسب قطر درونی ستون بصورت زير تنظيم می شود:

Flowrate(ml/min)	Column internal diameter (mm)
20	2
40	3
60	4

در مورد ستونهای کاپيلاری فلوريت برحسب نوع گاز تنظيم می شود:

Carrier gas	Linear velocity (cm/s)
H2	30-40
He	20-30
N2	10-20

 

فشاری که به سيستم اعمال می شود به طول و قطر داخلی ستون بستگی دارد. (جدول 10 ص 52).

برای تنظيم فلوريت در ستون packed  از فلومتر صابونی استفاده می شود.

               

 

برای ستونهای کاپيلاری گونه ای به ستون تزريق می شود که توسط ستون بارداری نشود بعد زمان خروج را اندازه گيری می کنند. با توجه به زمان و طول ستون سرعت را می توان محاسبه کرد.

اگر قطر داخلی ستون mm 52/0 باشد می توان از فلومتر صابونی استفاده کرد.

 

روشهای بهينه سازی فلوريت

1-محلولی از نمونه مورد نظر را با غلظت حدود 1/0% وزنی درست می کنيم بطوری که بتواند در آشکار ساز علامت قابل قبولی ايجاد کند.

2-سرعت جريان بهينه از روی جدول تنظيم می کنيم.

3-دمای ستون را طوری تنظيم می کنيم که ترکيب موردنظر 10-5 دقيقه بعد از گونه بازداری نشده از ستون خارج شود.

4-حدود µl1 از نمونه را به ستون تزريق و کروماتوگرام را ثبت می کنيم.

5-زمانهای دقيق بازداری و پهنای پيک را محاسبه و N را بدست می آوريم.

7-سرعت جريان را به 10% مقدار اوليه تغيير می دهيم و مراحل فوق را تکرار و مجددا N را بدست می آوريم. اين عمل را 10-8 بار تکرار می کنيم و بعد H را برحسب ν رسم نموده و از روی نمودار مقدار بهينه ν را بدست می آوريم.

تکنيکهای تزريق با سرنگ ((Syringe injection techniques

تزريق خوب تکرارپذيری را افزايش می دهد، شکل مناسبی از پيکها را ارائه می کند و مانع آلوده شدن محل تزريق می شود. بسته به نوع سرنگ، نوع محفظه تزريق، ماتريس نمونه و حجم نمونه تزريقی روشهای مختلف کلاسيک برای تزريق وجود دارد.

قبل از انجام تزريق، اولين موضوع تميز کردن سرنگ است. شستشوی سرنگ بسيارمهم است. سرنگ را بايد مرتبا (حداقل بيش از ده بار)  با حلال نمونه و سپس با نمونه بشوييم. اگر نمونه­هايی با غلظت­های متفاوت داشته باشيم (مثلا برای منحنی کاليبراسيون) بايد سرنگ را با نمونه ها به ترتيب  افزايش غلظت شستشو دهيم. اما درصورتيکه بخواهيم نمونه رقيق را تزريق کنيم ابتدا بايد سرنگ را با حلال و سپس با محلول رقيق شستشو دهيم. اگر چند نمونه با غلظتهای مختلف داشته باشيم  توصيه می شود بعد از هر تزريق سرنگ را ابتدا با حلال و بعد با نمونه شستشو دهيم (با همان تعداد دفعاتی که ذکر شد). اگر سرنگ به اندازه کافی موجود باشد بهتر است برای هر نمونه از يک سرنگ استفاده شود. پس از اتمام کار روزانه سعی شود ابتدا سرنگ را با حلال نمونه ها و سپس با حلال ديگری شستشو دهيم تا اثر حلال قبلی از بين برود. مثلا اگر حلال نمونه دکان يا نرمال اکتانول باشد سرنگ را ابتدا با هگزان و نهايتا با يک حلال فرار مانند متانل يا استون شستشو می دهيم.

بايد سعی شود از سرنگهايی استفاده شود که سوزن آنها قابل تعويض است زيرا احتمال خرابی سرنگهايی که سوزن سرخود دارند وجود دارد.

 

مسئله بعدی شيوه های تزريق کلاسيک است.

Making an injection

 

Type of syrings:

1.                plunger in needle

2.                plunger in barrel

هر دو نوع سرنگ برای تزريق در ستونهای packed و تزريقگر PTV مناسبند.

 

Plunger in needle

در اين نوع سرنگ نمونه در داخل سوزن اقامت دارد و به هيچ وجه وارد سرنگ نمی شود. از اين سرنگ برای تزريق نمونه های به اندازه µl1 وکمتر استفاده می شود. اين سرنگها برای cold on column و splitless مناسب نيستند اما در بقيه روشها می توان از آنها استفاده کرد. بسته به نوع سرنگ، روش تزريقی مشخصی را بايد بکار برد. در اين نوع سرنگ حجم مرده نداريم. شيوه کلاسيک تزريق با اين سرنگ بدينصورت است که ابتدا نمونه را به مقدار مورد نياز به درون سرنگ می کشيم سپس سوزن را وارد محل تزريق نموده و تزريق را انجام می دهيم و به مدت  5 ثانيه سوزن را در داخل محل تزريق نگه می داريم تا تمام گونه از نوک سوزن به محل تزريق منتقل شود.

 

Plunger in barrel

در اين نوع سرنگ نمونه به داخل سرنگ کشيده می شود. اين سرنگ برای نمونه های گازی و مايع بکار می رود. سرنگ مخصوص نمونه های گازی بايد کاملا سيل شده باشد. شيوه تزريق بدينصورت است که حجم معينی از نمونه را به داخل سرنگ وارد می کنيم سپس تمام محتويات را به داخل barrel می کشيم و سوزن را وارد محل تزريق می کنيم و حدود 5 ثانيه صبر می کنيم تا دمای سوزن با محل تزريق به تعادل برسد بعد تزريق را انجام می دهيم و خيلی سريع سرنگ را بيرون می کشيم. در مورد اين سرنگها هميشه با اين مشکل مواجهيم که مقداری از نمونه داخل سرنگ می ماند و چون از تزريقی به تزريق ديگر نمونه داخل سرنگ باقی می ماند برای رفع اين مشکل بايد از solvent plug injection استفاده شود. در اين سيستم قبل از اينکه نمونه به داخل سرنگ کشيده شود µl1 از حلال نمونه را به داخل سرنگ می کشيم سپس انتهای سرنگ را داخل نمونه قرار داده و حجم مورد نياز را به داخل سرنگ می کشيم و به روش ذکر شده تزريق را انجام می دهيم. با اين شيوه تقريبا تمام نمونه به داخل محل تزريق وارد می شود. سيستم ديگر air plug injection است که در آن حدود µl2 هوا را به داخل سرنگ می کشيم سپس نمونه را به حجم موردنياز به داخل سرنگ کشيده و به روش مذکور نمونه را تزريق می کنيم.

Setting the oven temperature

در GC می توان از دو نوع روش حرارتی استفاده کرد.

1-ايزوترمال

2-برنامه دمايی

انتخاب اين دو روش بسته به سيستم تزريق، نوع ستون و سادگی يا پيچيدگی نمونه است. مثلا در روش on column نمی توان از ايزوترمال استفاده کرد، اما اگر مخلوط ساده باشد معمولا از ايزوترمال و در صورت پيچيده بودن نمونه از برنامه دمايی استفاده می شود.

 

چگونه دما را تنظيم کنيم؟

1-با استفاده از مراجع

2-اگر مخلوط جديد باشد از را آزمون وخطا خيلی مشکل است ولی يک روش علمی ارائه شده که مختصرا به آن اشاره می شود.

                           

 

Establishing isothermal conditions

1-دمای محل تزريق و آشکارساز را تنظيم می کنيم و گاز حامل را با سرعت جريان بهينه به سيستم وارد می کنيم.

2-برنامه دمايی را از دمای اتاق تا   ºC 10 کمتر از دمای تحمل ستون با سرعت min /ºC 10به سيستم اعمال می کنيم.

3- نمونه را تزريق و برنامه را اجرا می کنيم.

4-از روی زمان خارج شدن گونه موردنظر دمای آنرا محاسبه می کنيم.

5-دمای ستون را ºC 20 کمتر از دمای مشاهده شده تنطيم می کنيم (ايزوترمال).

6-نمونه را تزريق و مشاهده می کنيم که آيا جداسازی کامل است يا خير. اگر کامل نبود دما را ºC 5 کاهش می دهيم و اين عمل را مجددا انجام می دهيم. اگر جداسازی به اين شيوه انجام نشد يا از ستونی استفاده می کنيم که ضخامت فاز ساکن يا طول آن زيادتر باشد و يا از برنامه دمايی استفاده می کنيم. اگر اينها موثر نشد ستون را عوض می کنيم.

Establishing temperature programmed conditions

دمای محل تزريق و دتکتور را تنظيم و گاز حامل را باز می کنيم. برنامه دمايی از دمای محيط تا ºC 10 کمتر از دمای تحمل ستون تنظيم و اجرا می کنيم. بعد کروماتوگرام حاصله را مشاهده می کنيم. دمای خارج شدن اولين و آخرين پيک مورد نظر و همچنين دمای آخرين پيک کروماتوگرام را بدست می آوريم. در مرحله بعدی دمای اوليه را ºC 20 کمتر از دمای خارج شدن اولين ترکيب موردنظر تنظيم می کنيم. سپس 1 دقيقه تحت شرايط ايزوترمال در آن دما تنظيم می کنيم و در مرحله بعدی با سرعت/min  ºC 5 برای ستونهای کاپيلاری و با سرعتºC/min  10 برای ستونهای packed دما را افزايش می دهيم.

                               

 

بعد از اتمام ramp بمدت 5 دقيقه بصورت ايزوترمال کار می کنيم. مجددا وقتی شيوه خارج شدن پيکها را مشاهده می کنيم می توانيم مجددا برنامه جديدی را به سيستم اعمال کنيم و اين کار را تا آنجايی ادامه می دهيم که جداسازيها بطور کامل صورت پذيرد.

در هريک از اين روشها (ايزوترمال و برنامه دمايی) بعد از اتمام جداسازي دما را به ماکزيمم دمای تحمل ستون نزديک می کنيم و زمان مشخصی تحت آن شرايط کار می کنيم تا ترکيبات ناخواسته از ستون خارج شوند و سيستم برای کار بعدی آماده شود.

                            

ارزيابی يک روش کروماتوگرافی

برای ارزيابی يک روش از پارامترهای زير استفاده می کنيم:

:Sensitivity واحد وزن نمونه بر واحد زمان يا به واحد غلظت تعريف می کنيم هرقدر به مقادير کمتری پاسخ دهد حساسيت بيشتر است.

:Detectability توانايي تشخيص سيگنال از زمينه است و به دو شکل تعريف می شود.

1-2(S_d)blank: اين مقدار تئوری است که در عمل نمی توان  مشاهده نمود.

2-غلظتی از نمونه که بتواند علامتی به اندازه 10 برابر S_d بلانک ايجاد کند.

Accuracy: نزديکترين مقدار اندازه گيری شده به مقدار واقعی

Precesion: تکرارپذيری (نزديکی جوابها به يکديگر)

:Reproducibility يک دستگاه تا چه حد تحت شرايط مختلف چه از نظر زمانی يا اپراتوری جوابهای تکرارپذيری در اختيار قرار می دهد.

Dynamic linear range

 

Columns

ستون قلب دستگاه GC است. در GLC ستونها به دو دسته packed و کاپيلاری تقسيم می شوند.

 

قطر داخلی(ميلی متر)	طول ستون(متر)	جنس ستون		نوع ستون
4-2	4-5/0	شيشه­ای		Packed
		Al	فلزی
		Cu
		steel
				capillary

 

داخل ستون packed با يک ماده پرکننده پر می شود. پرکننده از دو بخش تشکيل می شود:

 1-ساپورت يانگه دارنده

 2-فاز مايع

 

نگه دارنده: دياتومه را تحت دمای بالا و عبور گاز بی اثر حرارت می دهند تا ترکيبات آلی از آن خارج و باقيمانده که يک بستر سيليکايی است به عنوان نگه دارنده استفاده شود.

 

انواع نگه دارنده:

1-Chromosorb P(pink): برای تهيه اين نوع پس از خشک شدن دياتومه تحت ºC 900 گاز نيتروژن از آن عبور می دهند تا تمام ترکيبات آلی از آن خارج شوند. سپس بستر سيليکايی را خرد و مش مورد نظر را تهيه می کنند. سطح آن m²/g4 است و لذا به علت سطح بزرگی که دارد برهم کنشهای زيادی دارد.

2-Chromosorb W: دياتومه را باکربنات سديم حرارت می دهند تا بشکل مذاب درآيد. بعد از مدت مشخصی در دمای ºC 900 تحت گاز بی اثر قرار می دهند تا کربنات اضافی از سيستم خارج شود بعد آنرا خرد می کنند. اختلاف آن با قبلی اين است که سطح آن کمتر است (m²/g 1) و برهم کنش آن با گونه ها ضعيف تر است.

پس از تهيه نگه دارنده لازم است مايع را در سطح نگه دارنده تثبيت کنيم.

 

روشهای نشاندن فاز ساکن مايع روی نگه دارنده

1-فيزيکی

2-شيميايی

 

روش شيميايی

اين روش برای ستونهای packed مرسوم نيست بلکه روش فيزيکی مرسوم تر است.

 

 

                                                     

ادامه نوشته

 

کروماتوگرافی

 

بخش اول: تئوری

 

كروماتوگرافی گازیِ

كروماتوگرافی، دسته بزرگی از روشهای جداسازی را در برمی گيرد كه همگی مبتنی بر توزيع اجزاء يك مخلوط بين دو فاز و تبادل مداوم و دو طرفه اجزاء، بين دو فاز مزبور هستند كه توزيع مداوم اجزاء مخلوط بين دو فاز، اساس جداسازی اجزاء می‌باشد. يكی از اين دو فاز بستر ساكنی با سطح تماس بسيار وسيع است و فاز ديگر متحرك است كه ضمن عبور از بين خلل و فرج فاز ساكن با آن به تبادل مواد می پردازد و بطوريكه در هر نقطة تماس تعادلی بين غلظت مواد محلول در دو فاز بر اساس ضرايب توزيع مواد در اين فاز وجود دارد.

 

انواع كروماتوگرافی

چهار روش اساسی كروماتوگرافی مايع كه بر مبنای مكانيسمهای مربوطه نامگذاری شده‌اند عبارتند از:

1 - كروماتوگرافی ما يع-جامد

2 - ‌كروماتورگرافی مايع-مايع

3 - كروماتوگرافی تبادل يونی

4 - كروماتوگرافی ژل تراوا،  ژل صافی يا اندازه-طردی

روشهای 1و2 و 3 براساس ميل تركيبی و روش 4 براساس اندازه مولكولی می‌باشد. در كروماتوگرافی ژلی مولكولها براساس اندازه طبقه بندی می‌شوند و جداسازی اندازه مولكولی بوسيله يك نوع ژل اسفنجی كه برای فاز متحرك مناسب است صورت می گيرد.

42

mm  3/1 =  3:4= خطای متوسط

9/0%=100×142/1.3=متوسط خطای نسبی

 

5-چنانچه متوسط خطای نسبی از 3 درصد تجاوز کند، آزمايش را مجدد ا تکرار کنيد.

 

ادامه نوشته

اشنایی باspm,afm,sthm

آشنايي با ميكروسكوپ هاي پروبي روبشي(SPM)

در اين مقاله به بررسي و آشنايي با دو نوع از ميكروسكوپ‌هاي پروبي روبشي مي‌‌پردازيم.البته اين شرح و توضيح براي ميكروسكوپ AFM به اختصار و برايSThM  كمي مفصل تر خواهد بود.

آشنایی با میکروسکوپ نیروی اتمی ((AFM:

میکروسکوپ نیروی‌اتمي[1] یکی‌ازانواع میکروسکوپ‌های پروبی روبشی[2] می‌باشد. اساس کار همه‌ی میکروسکوپ‌های پروبی روبشی آن است که سطح نمونه توسط یک سوزن نوک تیز یا پروبی که نوک آن بصورت تک اتمی است روبش می شود. این سوزن روبنده به خاطر ابعاد بسیار کوچک خود می‌تواند کوچکترین پستی و بلندی موجود در سطح را (در حد نانومتر) حس نماید. بسته به طبیعت برهم‌کنش‌های موضعي‌، می توان تصویری سه‌‌بعدی از پستی و بلندی سطح، ساختار الکترونیکی ، ساختار مغناطیسی یا هر خاصیت موضعی دیگر به دست آورد.بسته به‌اینکه اطلاعات گرفته‌شده توسط سوزن با چه مکانیزمی قابل دریافت باشد ،سیستم‌های میکروسکوپی متفاوتی بوجود آمده است. یکی از این سیستم‌ها با تابانیدن نور لیزر و بررسی میزان تغییرات بازتاب آن در اثر نوسانات سوزن در روی سطح، اطلاعات را دریافت می‌کند. در این روش نوع ارتباط سوزن با سطح نمونه توسط نیروهای اتمی است و به همین علت این میکروسکوپ نیروی اتمی یاAFM نام گرفته است. پس AFM بر پایه نیروی الکترونی بین نوک پروب میکروسکوپ و نمونه است. بسته به فاصله بین نوک پروب و نمونه ، نیروهای مختلف در برهم‌کنش بین نوک پروب و سطح نمونه نقش اساسی دارند. برای مثال وقتی نوک پروب بسیار نزدیک به نمونه باشد این نیرو قسمتی از نیروی دفع کننده‌ی واندروالس است. وقتی نوک پروب از سطح نمونه دور می‌شود، یک نیروی جاذبه بین نوک پروب و نمونه نقش مهمی را بازی می‌کند. از آنجایی که در AFM برهم‌کنش اتمی بین نوک پروب میکروسکوپ و سطح نمونه مهم است، لذا این روش بستگی به رسانا بودن نمونه ندرد. اساس کار AFM به این صورت است که نوک پروب این میکروسکوپ به یک تیرک[3] متصل است که تغییر در نیروی اتمی آن را خم می‌کند. این سوزن از جنس سیلیکون یا نیترید سیلیکون بوده و ابعادی  در محدوده نانومتر دارد. با استفاده از یک تیرک با ضریب فنر مشخص، می‌توان میزان نیروی وارد شده به تیرک و در نتیجه میزان جابجایی آن را به دست آورد.در واقع نیروی وارد شده به سوزن، تیرک را خم کرده و بدین طریق می توان میزان نیروی وارد شده به سوزن رابا توجه به قانون هوک بدست آورد. برای اندازه گیری میزان جابجایی تیرک در این میکروسکوپ ها از پرتو لیزر استفاده می شود. شکل زیر:

برای تصویربرداری از طریق AFM معمولا از دو روش استفاده می شود:

1)     روش تماسی  

2)     روش غیرتماسی

در روش تماسی نوک پروب به نمونه تماس پیدا می کند و نیروی دافعه بین اتم های سطح نمونه و نوک پروب، نیروی غالب در این روش است. در این روش نیروی اعمالی به نوک پروب ثابت است. با استفاده از دنبال کردن انحرافات بوجود آمده در تیرک در اثر حرکت سوزن میکروسکوپ روی سطح نمونه ، می توان ساختاری از سطح نمونه را به دست آورد.

در روش غیر تماسی تیرک در فرکانسی نزدیک به فرکانس طبیعی خود لرزش می کند و نوک پروب بسیار نزدیک به نمونه بوده و نیروی جاذبه بین اتم های سطح نمونه و نوک پروب نیروی غالب است. تغییرات در نیروهای اتمی بین تیرک و سطح ماده را می توان از تغییرات در دوره تناوب فرکانس طبیعی تیرک متوجه شد. با کاهش فاصله نوک پروب با سطح نمونه که منجر به افزایش نیرو می شود، دامنه نوسان تیرک کاهش می یابد. با استفاده از دنبال کردن تغییرات دوره تناوب فرکانس طبیعی تیرک می توان ساختاری از سطح نمونه را به دست آورد.

 

آشنايي با ميكروسكوپ گرمايي روبشي (SThM):

امروزه یکی از روشهای مشاهده و آنالیز مواد، بویژه مواد پلیمری، استفاده از تکنیک های آنالیز میکروگرمایی[4] می باشد.

از جمله روش های گرمایی می توان به DSC [5]، TGA [6]، TMA [7]، DMA [8]وSThM  [9] اشاره کرد که تکنیک های مطمئن و شناخته شده ای برای تعیین مورفولوژی و شناسایی ترکیبات پلیمری می باشند.

در این روشها می توان با توجه به تغییرات دمایی، هدایت گرمایی و پایداری حرارتی مواد مورد مطالعه، آنها را مشخصه یابی کرد. با بررسی تغییرات کمیاتی مانند آنتالپی، وزن، طول، سفتی و...  با دما، فرآیند هایی مثل بلورینگی، یا چگالی در محل اتصالات عرضی [10] قابل مطالعه می باشند.

اصولاً هنگامی که صحبت از آنالیزهای میکرو گرمایی می شود منظور آنالیزهای حرارتی است که روی نمونه هایی با ابعاد کوچک   انجام می شود و از طرفی دقت تصویربرداری هم تا زیر می باشد.

میکروسکوپ  SThMاز روش های آنالیز میکروگرمایی برای تصویربرداری  و مشخصه یابی استفاده می کند. این میکروسکوپ از یک حسگردمایی مینیاتوری مثل یک ترموکوپل یا دماسنج مقاومتی، به جای سوزن تیزی که در AFM  به کار میرود استفاده می کند. این حسگر می تواند در سرتاسر سطح نمونه حرکت کرده و از توزیع دمایی سطح آن تصویربرداری کند، و مثلا جهت آشکارسازی نقاط گرم در قطعات نیمه هادی بکار رود. با کنترل کردن دمای سوزن (از طریق تاباندن لیزر به سوزن یا با گرمای ژولی ناشی از جریان عبوری از نوک سوزن)  و شار گرمایی بین سوزن و سطح، می‎توان تصاویری به دست آورد که تضاد رنگی موجود در آنها به خواص انتقال حرارت نمونه (مثل هدایت گرمایی وپخش گرمایی) بستگی دارد.

اولین آزمایشات با SThM توسط Williams و wickramasinghe انجام شد. بعدها جهت غلبه بر محدودیت های حاصل از SThM های اولیه، Majumdar پیشنهاد کرد، از یک بازوی AFM که متشکل از یک جفت سیم فلزی غیر همنام بود، استفاده کنند. این دو سیم، با هم یک اتصال ترموکوپل در نوک سوزن تشکیل می­دادند. با این روش علاوه بر آنکه، از خود AFM برای اندازه گیری توپرگرافی سطح استفاده می شود، در همان زمان نیز توزیع گرمایی قطعات الکترونیکی انرژی زا، با دقت زیر میکرونی، نقشه برداری می شود. امروزه از تکنیک های متفاوتی برای ترکیب بازوی AFM با یک روش دماسنجی موضعی، استفاده می شود. از جمله

-       بازوهای ترموکوپلی [11]

-       دماسنج مقاومتی [12]

در اشکال زیر یک میکروسکوپ SThM نمایش داده شده که در نوک سوزن آن از یک دماسنج مقاومتی استفاده شده است. در این حالت سوزن AFM از سیم Wollaston ساخته می­شود. این سیم از یک هسته نازک پلاتین به قطر  که با یک پوشش ضخیم نقره به قطر  پوشیده شده است، تشکیل می­شود . در ابتدا حلقه ای از سیم ساخته می­شود، سپس نقره اطراف آن بطور شیمیایی، زدایش می شود و فقط طول کمی از هسته پلاتین آشکار می­ماند که به عنوان یک دماسنج مقاومتی مینیاتوری عمل می کند.

  با استفاده از آنالیزهای میکروگرمایی از جمله SThM می توان به اهداف ذیل دست یافت.

1)     تصویر برداری [13]

      -استفاده از میکروسکوپ حرارتی در مد فعال [14]

      - استفاده از میکروسکوپ حرارتی در مد غیر فعال [15]

2)     آنالیزهای حرارتی موضعی [16]

           - گرماسنجی [17]

      - ترمومکانومتری [18]

3) طیف سنجی [19]

       - آنالیز مادون قرمز [20]

       -  آنالیز جرمی [21]

 1)     تصویر برداری :

 همانگونه که اشاره شد ، میکروسکوپ SThM از یک حسگرحرارتی کوچک به عنوان سوزن استفاده می کند . این میکروسکوپ دارای دو مد می باشد: مد فعال و مد غیر فعال .

   - مد فعال

در مد فعال ، سوزن به عنوان یک چشمه گرمایی عمل می کند، همانند یک دماسنج. در واقع وقتی یک دماسنج مقاومتی کوچک به عنوان سوزن به کار می رود، تضاد موجود در تصویر، نشان دهنده تغییرات در خواص گرمایی هر نقطه از نمونه می باشد. در همان زمان، از خود سوزن به عنوان مولد امواج گرمایی استفاده می شود و در نتیجه ما می توانیم مطابق با عمق نفوذ امواجی که با فرکانس انتخابی ما تغییر می کنند، بیشینه‌‌ ی عمق نمونه که باید از آن تصویر گرفت را کنترل نماییم.

اندازه گیری همزمان داده های گرمایی، ابزاری برای مطالعه خواص فیزیکی و ترکیبات شیمیایی پلیمرها فراهم می آورد. بویژه به ما امکان مطالعه فصل مشترک ها را علاوه بر سطوح می دهد.و بدین طریق نقاط گرم[22] و همچنین نقائص ایجاد کننده نقاط گرم در مدارهای مجتمع و قطعات نیمه هادی، آشکار سازی می شوند.

   - مد غیر فعال:

در مد غیر فعال، سوزن تغییرات دمایی القا شده از اطراف (انتقال گرما از داخل نمونه و جذب نور فروسرخ و...) را اندازه می گیرد (مثل یک ترموکوپل عمل می کند).

در واقع در این مد، برای افزایش قدرت تفکیک در اندازه گیری گرمایی روی مدارهای مجتمع و قطعات نیمرسانا، از حسگرهای مقاومتی نزدیک میدانی یا حسگرهای ترموکوپل در ترکیب با بازو، استفاده می شود.

2) آنالیز های حرارتی موضعی:

   - گرماسنجی و مکانومتری:

آنالیزهای موضعی ترمومکانیکی و گرماسنجی، با اضافه شدن به تکنیکSThM  باعث افزایش تفکیک ویژه فضایی به دو روش معتبر انگشت نگاری شیمیایی می شوند:

1) MTDSC (Modulated Temperature Differential Scanning Calorimetry)          

2) DMA (Dynamic Mechanical Analysis)

در هر دو روش از یک افت دمایی [23]، برای قرار دادن نمونه در معرض پدیده هایی مثل ذوب شدن یا دمای تبدیل شیشه24، استفاده می شود.

درMTDSC، سیگنال شارگرمایی چرخه ای، فقط ظرفیت گرمایی معکوس را که با ارتعاشات مولکولی همراه است می بینید. از سوی دیگر اندازه گیری دقیق پدیده های گرمازایی و گرماگیر بودن که با رویدادهای کنترل شده جنبشی همراه است، نیزامکان پذیر می باشد.

درDMA، رویدادهای گرمایی بواسطه تغییرات در قسمت های حقیقی و موهومی مدول‎های کشسان، آشکار می شوند.

3) طیف سنجی:

   - طیف سنجی IR:

اگر سطح نمونه  توسط تابش فروسرخ، برتابیده شود و سوزن در مد اکتیو باشد، اثر فوتو گرمایی ناشی از جذب انرژی مخصوص IR توسط نمونه، جهت به دست آوردن طیف IR نمونه، استفاده می شود.

   - طیف سنجی جرمی و کروماتوگرافی گازی:

همانگونه که آنالیزهای گرمایی موضعی به ما اجازه می دهند، خواص مناطق خاص از یک تصویر میکروسکوپی را مشخصه‌یابی کنیم، دو مد هم وجود دارد که ما را قادر می سازد، ترکیب شیمیایی این مناطق را شناسایی کنیم.

آن دو مد عبارتند از:

1) PTMS (Photo Thermal Micro Spectroscopy)

2) GC-MS(Gas Chromatography / Mass Spectroscopy)

قابلیتی که به تازگی توسعه پیدا کرده است، آنالیز گاز تشکیل شدۀ موضعی با استفاده از اسپکتومترجرمی(MS) و (GC-MS) می باشد. هدف توسعه گستردۀ آنالیز میکروگرمایی محدوده های مشخص، مشخصه ها و آلودگی‌ها می باشد.

در این جا بطور خاص به بررسی طیف سنجی ‏GC-MS می‏پردازیم:

در طیف‏سنجی GC-MS، سوزن گرمایی، با توجه به تصویر، روی نقطه مورد نظر ما قرار می‏گیرد و به سرعت تا دمای  گرم می‏شود. در این دماها، مواد مختلف تشکیل دهندۀ نمونه پایرولیز(تجزیه) خواهند شد. توده[24] تشکیل شده از نمونه‏های گازی تولید شده، به داخل یک تیوب با مادۀ جاذب مناسب، هدایت شده و به تله می‏افتد. لازم به ذکر است که تیوب در نزدیکی سوزن گرمایی قرار می‏گیرد. سپس تیوب جاذب، جهت آنالیز و تفکیک گازهای به دام افتاده، با استفاده از GC-MS اسپکتروسکوپی، در یک بخش واجذب گرمایی قرار می‏گیرد.

جمع بندی:

-       میکروسکوپ SThM، در واقع همان  AFMاست که از یک سنسور حرارتی کوچک به عنوان سوزن استفاده می کند و بر مبنای روش های آنالیز میکروگرمایی استوار است.                                                                                                                                 

-       با یک میکروسکوپ SThM همزمان قادر به انجام تصویر برداری و مشاهده ساختار ماده،آنالیز های حرارتی و پی بردن به خواص ماده و طیف سنجی و آشکارسازی ترکیبات شیمیایی ماده می باشیم.

در مد تصویر برداری، هر چه هدایت گرمایی نمونه بیشتر باشد، ماده روشن تر(به رنگ های مایل به زرد) دیده خواهد شد.

-        موارد دیگر کاربرد SThM عبارتند از:

*       علم پلیمر

*       داروشناسی

*       میکروالکترونیک (قطعات نیمه هادی ها)

*       کالبد شناسی

*       بیولوژی سلولی

و....

- محدودیت های SThM  :

*       در تئوری ، سوزن های حرارتی گرم شده، قادر به اندازه گیری هدایت گرمایی کامل مواد، با استفاده از شار گرمایی بین نوک سوزن و نمونه، می باشند. اما در عمل بین سوزن و محیط اطراف، اتلاف گرما رخ می دهد و در نتیجه معمولا ناحیه تماسی بین نوک و نمونه ناشناخته می ماند. امروزه برای حل این مشکل از مواد سخت با هدایت گرمایی مشخص، جهت کالیبره کردن سیستم استفاده می کنند.

*       از طرف دیگر، مشکل دیگری که در ناحیه تماس وجود دارد، تاثیر زبری سطح، روی هدایت گرمایی مناطق مختلف نمونه می باشد. چرا که تغییرات در شیب سطح مورد مطالعه، ناحیه تماس سوزن را تغییر می دهد. بنابراین بهتر است، همواره تصویر توپوگرافی با تصویر گرمایی مقایسه شود تا دریابیم چه ویژگی هایی در تصویر گرمایی ناشی از تغییرات فضایی صحیح در هدایت گرمایی می باشد.

 

1.       اسپكتروفتومتر ناحيه مريی Spectrophotometer

2.     اورابنفش Spectrophotomاسپكتروفتومتر مeter

3.    پلاريمتري Polarimetry

4.     تعيين ضريب شكست مواد با رفركتومترRefractometer         

5.     اسپكتروفلوريمتريSpectroflourimetry

6.     اسپكتروفتومتري جذب اتمي Atomic Absorption

          7.روش طیف سنجی نور

8.آشکار سازی ارتعاش امواج با استفاده از روش های شیمیایی

         9. طيف‌سنجي جرمي (MS)

ادامه نوشته